OsHK3參與ABA誘導的抗氧化防護信號通路的轉錄調控及ROS的產生.pdf

1、干旱是影響作物生長及限制作物產量的重要環(huán)境因素。植物響應干旱脅迫的關鍵步驟是在胞內ABA迅速積累，啟動一系列適應脅迫的反應，包括氣孔關閉、累積抗?jié)B透物質、增強抗氧化防護系統(tǒng)提高干旱耐受性。有大量報道表明活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)作為第二信使介導了干旱脅迫下ABA誘導的適應脅迫的生理反應。高等植物中，雙組分系統(tǒng)(two-component system，TCS)參與感知和應對多種環(huán)境刺激誘發(fā)的信號，是通

2、過組氨酸激酶催化蛋白磷酸化與去磷酸化來感受、傳遞信號以響應外界環(huán)境的變化的一種信號系統(tǒng)。擬南芥中已有報道，干旱脅迫下ATHK1/AHK1位于ROS下游響應ABA信號調節(jié)質膜Ca2+通道引起氣孔關閉。然而干旱脅迫下HKs是否參與ABA誘導的抗氧化防護未見有報道。本實驗室前期，以ABA處理通過RT-PCR對OsHK家族的6個基因(OsHK1-6)進行篩選，發(fā)現(xiàn)OsHK3受ABA調控是通過ABA誘導產生的內源H2O2起作用的;另外證實OsHK

3、3亦參與ABA調控的抗氧化防護途徑。
　　基于上述的前期工作，為進一步闡明OsHK3在ABA調控的抗氧化防護通路中的作用，本研究在建立的水稻原生質體瞬時表達體系基礎上，將構建的OsHK3過表達載體35S: OsHK3-YFP通過PEG融合介導入原生質體內，培養(yǎng)16小時后進行ABA處理。實驗發(fā)現(xiàn)，轉入35S: OsHK3-YFP過表達載體的原生質體與轉入35S:YFP空載的對照相比，瞬時過表達OsHK3顯著上調受ABA誘導的抗氧化防

4、護信號通路中一些重要組分如蛋白激酶CCaMK、MAPK(OsMPK1、OsMPK5)，以及轉錄因子OsHsfA2、ZFP36的基因表達。另外通過PEG介導干擾OsHK3轉錄的dsRNA轉化原生質體24小時后研究發(fā)現(xiàn)，瞬時沉默OsHK3明顯降低OsDMI3（水稻中的CCaMK）、MAPK(OsMPK1、OsMPK5)，以及轉錄因子OsHsfA2、ZFP36的轉錄表達。反過來，原生質體中瞬時過表達35S:OsDMI3-YFP、35S:OsM

5、PK1-YFP、35S:OsMPK5-YFP，對OsHK3的轉錄水平?jīng)]有影響，且利用OsDMI3、OsMPK1的插入突變體驗證，發(fā)現(xiàn)OsHK3對OsDMI3、OsMPK1的插入突變不敏感，即CCaMK、MAPK不影響OsHK3的表達。綜上所述，ABA信號通路中，OsHK3調控受ABA誘導的OsDMI3、MAPK(OsMPK1、OsMPK5)，以及轉錄因子OsHsfA2、ZFP36的轉錄表達，且可能對CCaMK、MAPK的這種調控是不反饋

6、的單線性調節(jié)。
　　為進一步探討OsHK3在ABA誘導的抗氧化防護過程中與OsDMI3、OsMPK1的相互關系，我們利用OsDMI3、OsMPK1的插入突變體提取原生質體瞬時過表達OsHK3發(fā)現(xiàn)，與WT（野生型）相比，OsDMI3、OsMPK1突變體中瞬時過表達OsHK3不影響抗氧化酶SOD、APX的酶活性，且突變體中瞬時過表達OsHK3對ABA誘導SOD、APX的酶活升高沒有明顯影響。此結果表明OsDMI3、OsMPK1的插入突

7、變阻斷了OsHK3對ABA誘導的抗氧化防護的調控，OsHK3位于OsDMI3、OsMPK1的上游參與ABA誘導的抗氧化防護。
　　早前本實驗室報道了OsDMI3、OsMPK1參與ABA信號通路中的RBOH介導的ROS放大正反饋機制。為了探明OsHK3是否亦參與了此正反饋機制，我們利用水稻原生質體瞬時表達與沉默OsHK3，檢測受ABA誘導產生H2O2的NADPH氧化酶基因OsrbohB、OsrbohE的表達影響，以及用H2O2-敏感

8、熒光探針H2DCF-DA標記瞬時干擾OsHK3的水稻原生質體，激光共聚焦顯微鏡下觀察H2O2的產生結果顯示:瞬時過表達OsHK3能顯著上調OsrbohB、OsrbohE的轉錄表達，相反瞬時沉默OsHK3降低了OsrbohB、OsrbohE的轉錄水平，且阻斷了ABA對OsrbohB、OsrbohE的誘導;瞬時沉默OsHK3后，與水對照相比，原生質體中H2O2的含量明顯降低。結合早前H2O2誘導OsHK3的轉錄表達上調的實驗結果，說明OsH