PRRSV,PCV2和SS2多重PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合癥病病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬鏈球菌2型(SS2)這三種病原體每年均能給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成難以估量的經(jīng)濟(jì)損失。由于這三種病原體均能引起感染豬的呼吸道癥狀，且臨床發(fā)病癥狀極為相似，難以通過臨床診斷進(jìn)行確診。因此，對(duì)這三種病原體引起的疾病進(jìn)行早期鑒別診斷，進(jìn)而指導(dǎo)養(yǎng)殖戶采取有效的控制措施顯得尤為重要。
　　本試驗(yàn)根據(jù)Gene Bank中發(fā)布的PRRSV的nsp2基因、PCV2的全基因和SS2的16s

2、rRNA基因序列，分別找出其保守區(qū)并設(shè)計(jì)了三對(duì)特異性引物。建立并分別進(jìn)行了優(yōu)化檢測(cè)PRRSV、PCV2和SS2三種病原體的單重PCR方法和多重PCR方法。三種病原體的單重PCR檢測(cè)方法的反應(yīng)條件中退火溫度均確定為51.9℃，循環(huán)數(shù)的結(jié)果選定為35個(gè)循環(huán);其中PCV2和SS2的單重PCR反應(yīng)體系中（25μL體系）dNTP(2.5 mM)加入量均確定為3μL，引物(10μmol/L)加入量均確定為0.7μL; PRRSV的單重PCR反應(yīng)體系

3、中(50μL體系)Mg2+(25 mM)加入量確定為8μL，dNTP(10 mM)加入量確定為5μL，引物(10μmol/L)加入量均確定為2μL。本試驗(yàn)建立的單重PCR法具有較高的敏感性(可以檢測(cè)到的PRRSV，PCV2以及SS2的最低含量分別為1.37Pg，3.35 pg和5.23 pg)。三種病原體的多重PCR檢測(cè)方法的反應(yīng)條件中退火溫度均確定為51.9℃，Mg2+(25 mM)加入量確定為8μL，dNTP(10mM)加入量確定為

4、6μL，引物(10μmol/L)加入量均確定為2.3μL，循環(huán)數(shù)的結(jié)果判定為35個(gè)循環(huán)。多重PCR法不僅有高特異性，并且有較高的敏感度(可以檢測(cè)到PRRSV，PCV2以及SS2的最低含量分別為13.7 pg，33.5 pg和52.3 pg)。
　　在2012年9月份到2013年12月份之間，利用本試驗(yàn)所建立的PRRSV、PCV2以及SS2三種病原體的多重PCR法對(duì)收集的河北省保定、石家莊、邯鄲、邢臺(tái)、滄州、承德、張家口、衡水、廊坊

5、、唐山、秦皇島等11個(gè)地區(qū)的412份臨床癥狀疑似呼吸道疾病的組織樣品進(jìn)行了檢測(cè)，PRRSV，PCV2和SS2總陽性率分別為42.7％，26.5％和44.7％。對(duì)病料進(jìn)行PRRSV、PCV2和SS2混合感染的檢測(cè)，結(jié)果顯示PRRSV和SS2混合感染的總陽性率為11.2％，PCV2和PRRSV混合感染的總陽性率為15.0％，PCV2和SS2混合感染的總陽性率為12.4％。結(jié)果表明PRRSV、PCV2以及SS2的感染普遍存在于河北省地區(qū)的豬群