PPV、PRV和PCV-2三重PCR與PCV-2 LAMP檢測方法的建立及初步應用.pdf

1、本研究應用PCR技術和TaqMan(R)探針實時熒光定量PCR技術，建立豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)單項與三重二溫式PCR快速檢測方法及單項與三重實時熒光定量PCR(FQ-PCR)方法;探索應用環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術，建立簡單、靈敏、特異的PCV-2檢測方法。所建立檢測技術為實驗室快速檢測上述豬主要DNA病毒提供了可靠的方法，研究分為三個部分:
　　 一、PPV、PRV和PC

2、V-2單項及三重二溫式PCR方法的建立通過對GenBank登錄的PPV、PRV和PCV-2核苷酸序列比對分析，選出PPV的VP2基因、PRV的gH基因和PCV-2的ORF2基因為相對保守區(qū)域，利用生物學軟件篩選設計出3對高熔解溫度特異性引物，目的片段大小分別為142 bp(PPV)、300 bp(PRV)和469 bp(PCV-2)。經(jīng)條件優(yōu)化、敏感性試驗、特異性試驗及重復性試驗，建立了單項與三重二溫式PCR檢測方法。整個三重二溫式PC

3、R反應過程約需66 min，比三個常規(guī)單項PCR分別檢測所用總時間減少了近70％，比常規(guī)三重PCR節(jié)省了至少20％的時間;對三者陽性質(zhì)粒的檢出敏感性低至200拷貝;對其它豬常見病原（副豬嗜血桿菌、鏈球菌、CSFV、PRRSV、大腸桿菌和JEV）檢測無交叉反應;有較好的重復性和穩(wěn)定性。
　　 二、PPV、PRV和PCV-2單項與三重FQ-PCR檢測方法的建立根據(jù)TaqMan(R)探針實時熒光定量PCR原理，運用引物、探針設計軟件對

4、PPV的VP2基因、PRV的gH基因及PCV-2的ORF2基因分別設計一對引物和一條特異性探針，探針報告集團依次為:JOE(PPV)、TAMARA(PRV)和FAM(PCV-2)。經(jīng)條件優(yōu)化、敏感性試驗、特異性試驗及批內(nèi)批間重復試驗，建立了單項與三重FQ-PCR檢測方法。整個反應過程在70min內(nèi)完成;對陽性質(zhì)粒的檢出敏感性低至10拷貝;對其它豬常見病原檢測無交叉反應;批內(nèi)批間重復試驗CV％均小于3％，具有良好重復性;擴增效率E＞95％

5、，標準曲線R2＞0.99，具有良好的線性關系。
　　 三、PCV-2 LAMP檢測方法的建立根據(jù)LAMP技術原理，選取PCV-2的ORF2基因，利用在線Primer Explorer3.0軟件設計4條特異性引物。經(jīng)條件優(yōu)化、敏感性試驗和特異性試驗，建立了PCV-2LAMP檢測方法。該方法對PCV-2基因組DNA的檢出敏感性達0.5 pg;對其它豬常見病原檢測無交叉反應;陽性擴增產(chǎn)物經(jīng)酶切驗證，為預期條帶;反應產(chǎn)物中加入SYBR

6、GreenⅠ染料，可根據(jù)顏色變化，肉眼快速判斷結果。
　　 用所建立三聯(lián)PCR方法對205份臨床疑似病料樣品進行檢測，分別與常規(guī)單項PCR方法對比。結果顯示，單項和三重二溫式PCR方法對PPV、PRV和PCV-2檢測結果與常規(guī)單項PCR方法的總符合率均在97％以上;單項和三重實時熒光定量PCR方法對各相關病原檢出率均高于常規(guī)單項PCR方法:PPV高出0.38％，PRV高出0.97％，PCV-2高出1.96％。用所建立PCV-2