彎曲菌多重PCR檢測方法的建立及其初步應(yīng)用.pdf

1、彎曲菌(Campylobacterspp)是一種重要的食源性病原菌，可引起人類急性腸炎、格林巴利綜合癥、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、Reiter's綜合癥等多種疾病。人類常因攝入被彎曲菌污染的肉類、水、牛奶等而感染。目前許多發(fā)達(dá)國家已建立起完善的監(jiān)測和控制體系，并對該菌進行了較為深入的研究，而我國在這方面的研究相對滯后，調(diào)查報道較少。本研究的目的是：(1)優(yōu)選適合于彎曲菌大規(guī)模檢測和流行病學(xué)調(diào)查的常規(guī)培養(yǎng)方法；(2)建立空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌多重PC

2、R檢測新方法；(3)對揚州地區(qū)三個農(nóng)貿(mào)市場和某生豬屠宰加工廠空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌污染情況進行初步調(diào)查研究。 一彎曲菌常規(guī)培養(yǎng)方法的優(yōu)選 用燭缸法、微需氧罐法和二氧化碳培養(yǎng)箱法產(chǎn)生的微需氧環(huán)境培養(yǎng)彎曲菌，比較其對彎曲菌生物學(xué)特性的影響，結(jié)果表明微需氧罐法和二氧化碳培養(yǎng)箱法產(chǎn)生的氣體條件明顯優(yōu)于燭缸法，經(jīng)綜合評價選用二氧化碳培養(yǎng)箱法作為彎曲菌選擇性培養(yǎng)的方法。 用三種不同的選擇性培養(yǎng)基：國產(chǎn)CCDA、進口CCDA和

3、Campy-BAP培養(yǎng)彎曲菌，比較其生物學(xué)特性上的差異，結(jié)果表明Campy-BAP瓊脂和進口CCDA明顯優(yōu)于國產(chǎn)CCDA，經(jīng)綜合比較選用進口CCDA作為彎曲菌選擇性培養(yǎng)的培養(yǎng)基。 用7種方法保存彎曲菌，分別在凍存后第14、30、60、90、180天復(fù)蘇，比較不同保存培養(yǎng)基和保存溫度對彎曲菌保存效果的影響，最終選擇含20％甘油的BHI在-80℃保存作為彎曲菌保存方法。 二彎曲菌多重PGR檢測方法的建立 以16SrR

4、NA基因、mapA基因和CeuE基因作為靶基因，建立檢測空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的多重PCR方法?？漳c彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌能擴增出各自的特異性條帶，其他參考菌株均未擴增出條帶，這表明該方法具有較強的特異性。模擬污染試驗和敏感性試驗結(jié)果顯示，該方法對模擬污染樣品的檢測限達(dá)6CFU/10g生雞肉、6CFU/10g水和牛奶，最低能檢測出1.85pg的空腸彎曲菌DNA和2.1pg的結(jié)腸彎曲菌DNA，這表明該方法具有較高的靈敏度。應(yīng)用本研究建立的多重

5、PCR檢測方法對180份市售生雞肉樣品進行檢測，同時對不同檢測程序進行了比較研究，結(jié)果表明基于增菌培養(yǎng)和選擇性培養(yǎng)的多重PCR檢測方法優(yōu)于國標(biāo)檢測方法，可作為彎曲菌大規(guī)模檢測的新技術(shù)。 三食品和環(huán)境中彎曲菌污染率調(diào)查研究 為了解揚州市空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌在食品和環(huán)境中的污染情況，共采集揚州市三個農(nóng)貿(mào)市場食品和環(huán)境樣品1355份和某生豬屠宰-加工銷售環(huán)節(jié)各類樣品680份，應(yīng)用本研究建立的多重PCR檢測方法對上述樣品中空腸

6、彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌污染率進行調(diào)查。結(jié)果顯示，空腸彎曲菌在A、B、C三個市場不同樣品中的平均污染率為10.92％，污染率最高的是市場A的生鮮雞肉樣品達(dá)19.92％，最低的是市場B的蔬菜樣品和市場C的污水樣品，未檢出陽性；結(jié)腸彎曲菌平均污染率為6.49％，污染率最高的是市場A的污水樣品，達(dá)11.76％，最低的是市場C的蔬菜樣品，未檢測到陽性；而兩種細(xì)菌混合污染的樣品平均污染率為0.89％，且主要集中在生雞肉和市場污水樣品中，新鮮蔬菜中未檢測

7、到混合污染。此外，市場B的冷凍雞肉樣品中空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的污染率顯著低于市場A和C的生鮮雞肉樣品(p＜0.01)。上述結(jié)果表明：(1)彎曲菌的污染率在不同市場間存在差異，且空腸彎曲菌的污染率顯著高于結(jié)腸彎曲菌(p＜0.01)(2)彎曲菌污染率在不同樣品中存在差異，其中生鮮雞肉的污染率顯著高于其他樣品(p＜0.01)(3)冷凍保存可使雞肉中彎曲菌污染率顯著降低。 生豬屠宰-加工-銷售各環(huán)節(jié)中，空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌平均污染率

8、分別為1.03％和8.53％，后者平均污染率顯著高于前者(p＜0.01)。污染率最高的是屠宰過程的大腸樣品，污染率分別為4％和41％，顯著高于其他環(huán)節(jié)，污染率最低的是宰前豬毛樣品，未檢測到陽性。這初步表明：(1)生豬屠宰加工流程和豬肉彎曲菌污染主要由結(jié)腸彎曲菌引起；(2)屠宰過程中腸及其內(nèi)容物處理環(huán)節(jié)是肉品加工過程中的關(guān)鍵控制點，肉品常可由于腸及其內(nèi)容物處理不當(dāng)而污染；(3)屠宰前對豬體表的淋浴有利于減少和清除病原微生物對豬胴體和生產(chǎn)線