玉米幼苗水分脅迫相關(guān)基因的克隆與分析.pdf

1、水分脅迫嚴重影響植物生長及作物生產(chǎn),它是主要的非生物脅迫因子之一.現(xiàn)在認為,數(shù)以百計的基因參與到植物對非生物脅迫的響應(yīng)中,然而,目前只有為數(shù)不多的基因的詳盡功能得到闡明,況且,這方面的大部分工作是在模式植物擬南芥上完成的.為了在玉米中發(fā)掘水分脅迫相關(guān)基因,通過抑制差減雜交(SSH)的方法,以20﹪PEG處理三葉期玉米的葉及根的cDNA為tester,對照為driver,構(gòu)建了一個含有960個克隆的差減文庫.為了進一步確認陽性克隆,所有克

2、隆經(jīng)過差示篩選(PCR-selected Deferential Screening),按照試劑盒的鑒定標準,從960個克隆中挑選出533個陽性克隆,并全部進行測序,共500個克隆測序成功.對所獲得的EST進行Cluster分析,發(fā)現(xiàn)共有190個獨立的(unique)ESTs,其中包括101個contigs和89個singletons.所有unique ESTs在GenBank上BLAST分析表明,該文庫包含了一些已經(jīng)研究過的玉米水分脅

3、迫相關(guān)基因,如:ZMrab17、ZMDBF1、ZMGRP、ZMSUCS1等以及一些與擬南芥、水稻或其它植物的水分脅迫相關(guān)基因具有很高同源性的EST.然而,仍有許多的EST的功能未知.根據(jù)其BLASTX的結(jié)果可以將有顯著同源性的EST分為13個功能組.為了進一步研究這些unique ESTs,利用cDNA Macroarray對其進行表達譜分析.用機械手將190個克隆的PCR產(chǎn)物點到尼龍膜上,每個克隆重復4次.以不同處理(PEG、干旱、A

4、BA、高鹽、冷)不同時間點的總RNA反轉(zhuǎn)錄標探針進行雜交.以表達量是對照的2倍或2倍以上為有意義的表達上調(diào).在PEG脅迫下分別有67、113個EST在葉、根部表達上調(diào);共有163個EST在干旱脅迫下表達上調(diào).在ABA、高鹽、冷處理時分別有116、55、24個EST表達上調(diào).利用Gene Cluster軟件進行表達譜的聚類分析發(fā)現(xiàn),在PEG處理下玉米的根和葉有不同的表達模式;PEG誘導表達的EST絕大部分也能被干旱脅迫誘導表達.通過數(shù)據(jù)分

5、析,發(fā)現(xiàn)一些EST所對應(yīng)的基因可能在脅迫的信號轉(zhuǎn)導中起作用.在差減庫中,發(fā)現(xiàn)一個全長的基因ZmGST7,進一步的Northern分析表明該基因受水分脅迫的誘導,并且在脅迫后期表達量很高.為了進一步研究它的功能,構(gòu)建了兩個表達載體(過量表達、誘導表達),并將進行轉(zhuǎn)化擬南芥.對轉(zhuǎn)基因擬南芥T2代植株進行性狀檢測,初步得出結(jié)果表明,該基因能夠明顯促進植物生長,并在低水平的滲透脅迫下能夠提高植物的抗性.除此之外,我們已經(jīng)從差減文庫中鑒定到許多受