玉米幼苗水分脅迫相關(guān)基因的克隆與分析.pdf

1、水分脅迫嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)及作物生產(chǎn),它是主要的非生物脅迫因子之一.現(xiàn)在認(rèn)為,數(shù)以百計(jì)的基因參與到植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)中,然而,目前只有為數(shù)不多的基因的詳盡功能得到闡明,況且,這方面的大部分工作是在模式植物擬南芥上完成的.為了在玉米中發(fā)掘水分脅迫相關(guān)基因,通過(guò)抑制差減雜交(SSH)的方法,以20﹪PEG處理三葉期玉米的葉及根的cDNA為tester,對(duì)照為driver,構(gòu)建了一個(gè)含有960個(gè)克隆的差減文庫(kù).為了進(jìn)一步確認(rèn)陽(yáng)性克隆,所有克

2、隆經(jīng)過(guò)差示篩選(PCR-selected Deferential Screening),按照試劑盒的鑒定標(biāo)準(zhǔn),從960個(gè)克隆中挑選出533個(gè)陽(yáng)性克隆,并全部進(jìn)行測(cè)序,共500個(gè)克隆測(cè)序成功.對(duì)所獲得的EST進(jìn)行Cluster分析,發(fā)現(xiàn)共有190個(gè)獨(dú)立的(unique)ESTs,其中包括101個(gè)contigs和89個(gè)singletons.所有unique ESTs在GenBank上BLAST分析表明,該文庫(kù)包含了一些已經(jīng)研究過(guò)的玉米水分脅

3、迫相關(guān)基因,如:ZMrab17、ZMDBF1、ZMGRP、ZMSUCS1等以及一些與擬南芥、水稻或其它植物的水分脅迫相關(guān)基因具有很高同源性的EST.然而,仍有許多的EST的功能未知.根據(jù)其BLASTX的結(jié)果可以將有顯著同源性的EST分為13個(gè)功能組.為了進(jìn)一步研究這些unique ESTs,利用cDNA Macroarray對(duì)其進(jìn)行表達(dá)譜分析.用機(jī)械手將190個(gè)克隆的PCR產(chǎn)物點(diǎn)到尼龍膜上,每個(gè)克隆重復(fù)4次.以不同處理(PEG、干旱、A

4、BA、高鹽、冷)不同時(shí)間點(diǎn)的總RNA反轉(zhuǎn)錄標(biāo)探針進(jìn)行雜交.以表達(dá)量是對(duì)照的2倍或2倍以上為有意義的表達(dá)上調(diào).在PEG脅迫下分別有67、113個(gè)EST在葉、根部表達(dá)上調(diào);共有163個(gè)EST在干旱脅迫下表達(dá)上調(diào).在ABA、高鹽、冷處理時(shí)分別有116、55、24個(gè)EST表達(dá)上調(diào).利用Gene Cluster軟件進(jìn)行表達(dá)譜的聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn),在PEG處理下玉米的根和葉有不同的表達(dá)模式;PEG誘導(dǎo)表達(dá)的EST絕大部分也能被干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá).通過(guò)數(shù)據(jù)分

5、析,發(fā)現(xiàn)一些EST所對(duì)應(yīng)的基因可能在脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用.在差減庫(kù)中,發(fā)現(xiàn)一個(gè)全長(zhǎng)的基因ZmGST7,進(jìn)一步的Northern分析表明該基因受水分脅迫的誘導(dǎo),并且在脅迫后期表達(dá)量很高.為了進(jìn)一步研究它的功能,構(gòu)建了兩個(gè)表達(dá)載體(過(guò)量表達(dá)、誘導(dǎo)表達(dá)),并將進(jìn)行轉(zhuǎn)化擬南芥.對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥T2代植株進(jìn)行性狀檢測(cè),初步得出結(jié)果表明,該基因能夠明顯促進(jìn)植物生長(zhǎng),并在低水平的滲透脅迫下能夠提高植物的抗性.除此之外,我們已經(jīng)從差減文庫(kù)中鑒定到許多受