低磷脅迫響應(yīng)microRNA及靶基因的克隆和大豆遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、大豆是世界上最重要的油料作物之一。土壤中總磷含量很高,但大部分不能被作物吸收利用,此外磷肥的大量施用必定加劇環(huán)境污染。提高大豆對低磷脅迫的耐受性,對保護(hù)環(huán)境及大豆的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實意義。運(yùn)用基因工程的方法挖掘相關(guān)基因,并通過遺傳轉(zhuǎn)化將目的基因?qū)氪蠖?是改良大豆對低磷脅迫耐受性的一個重要途徑。
　　 近年來,microRNA及其靶基因的作用機(jī)理成為研究的熱點(diǎn)。microRNA是一類長21-25nt的內(nèi)源非編碼RNA,它們

2、通過在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)。microRNA399和microRNA398是兩個與擬南芥耐低磷脅迫相關(guān)的microRNA,在低磷條件下,能夠較快地做出響應(yīng)。本實驗構(gòu)建了擬南芥pre-microRNA399b和大豆microRNA398a靶基因GmSODC兩個植物表達(dá)載體,通過發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化根驗證這些基因的功能,通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化大豆子葉節(jié),獲得轉(zhuǎn)基因植株。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、通過PCR方法分別從擬南

3、芥和大豆中擴(kuò)增到了兩個目的基因(microRNA399b和GmSODC),采用LIC(Ligation—Independent cloning)法將目的基因連接到雙元植物表達(dá)載體pJG045上,將驗證后的質(zhì)粒采用凍融法導(dǎo)入到農(nóng)桿菌EHA105中,構(gòu)建成兩個植物表達(dá)載體。
　　 2、將目的基因分別連接到帶有GFP的植物表達(dá)載體pCX—DG上,采用凍融法導(dǎo)入到發(fā)根農(nóng)桿菌K599中,以大豆子葉節(jié)為受體,進(jìn)行了兩個目的基因功能的初步驗證