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文檔簡介
1、胰腺纖維化是與慢性胰腺炎(chronic pancreatitis)相伴隨的特殊的組織病理學(xué)特點,往往導(dǎo)致胰腺功能性組織喪失,富含連接組織的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix ECM)在胰腺內(nèi)沉積等后果。然迄今為止,胰腺纖維化過程精確的調(diào)控機制仍未明了。 胰腺星狀細胞(pancreatic Stellate cell,PSC)是產(chǎn)生胰腺纖維化的關(guān)鍵細胞,并最終導(dǎo)致慢性胰腺炎的形成。在此過程中有多種細胞因子參與,
2、而各種因子的產(chǎn)生途徑、相互作用機制不盡相同。激活素(Activin)最早是在性腺發(fā)現(xiàn)的糖蛋白激素,后來發(fā)現(xiàn)其作用不僅限于性腺,具有多種生物學(xué)功能,屬于TGF-β超家族的成員,其三種受體屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。激活素參與機體炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)過程,一定水平激活素不但呈劑量依賴性的促進PSC增殖并表達a平滑肌肌動蛋白(a—SMA),而且可增強其膠原蛋白分泌。內(nèi)皮素(endothelin ET)作為迄今所知最強的縮血管物質(zhì),其作用機制是通
3、過增加PSC的膠原合成和分泌,以及提高PSC的攝取與合成能力有關(guān)。整合素(Integrin)是位于細胞表面的糖蛋白受體家族分子,為介導(dǎo)細胞—細胞以及細胞—細胞外基質(zhì),且作為介導(dǎo)信號傳遞的膜分子,在許多重要的病理生理過程:如細胞增殖、分化、伸展和遷移、凋亡、炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等中起著十分重要的作用。 細胞因子在促進PSC活化、增殖、遷徙過程中,都要通過細胞信號傳導(dǎo)通路對PSC進行控制。C—Jun氨基端激酶(c—Jun
4、-Terminal kinase,JNK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen—activaed proren kinase,MAPK)信號傳導(dǎo)通路家族成員。MAPK廣泛參與細胞的多種生命過程,包括生長、分化、細胞周期調(diào)節(jié),腫瘤發(fā)生,細胞凋亡等。JNK主要參與ECM的合成。 漢丹肝樂是在臨床辯證的基礎(chǔ)上,以丹參、黃芪、漢防己堿、銀杏、赤芍等五味中藥組方而成。已有的研究證實,它可通過減輕肝細胞脂質(zhì)過氧化、保護肝細胞、抑制HSC增殖
5、及膠原合成、提高膠原酶活性、并促進膠原蛋白降解等多種機制,來發(fā)揮抗肝纖維化效應(yīng)。 本課題采用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)(包括免疫組化、RT-PCR,western blot等),檢測激活素、整合素、內(nèi)皮素在胰腺組織損傷修復(fù)及纖維化形成過程中的動態(tài)變化以及應(yīng)用藥物干預(yù)胰腺纖維化的形成。旨在探討激活素、整合素、內(nèi)皮素在慢性胰腺炎胰腺纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用和細胞內(nèi)傳導(dǎo)途徑以及藥物干預(yù)效果。本課題主要分為三部分:(1)慢性胰腺炎大鼠模
6、型的建立;(2)激活素、整合素、內(nèi)皮素在慢性胰腺炎胰腺組織中的表達;(3)漢丹肝樂對大鼠慢性胰腺炎胰腺纖維化干預(yù)的研究。 實驗方法: 1、實驗動物模型的建立 通過向Wistar大鼠膽胰管輸注含2%—硝基苯磺酸(TNBS)的10%乙醇PBS溶液復(fù)制慢性胰腺炎動物模型,在膽胰管中注射等量的10%乙醇PBS溶液復(fù)制對照組,干預(yù)組(模型組動物)術(shù)后第三天給予口服漢丹肝樂,大鼠術(shù)后分1、2、3、4、5、6、7周等觀察時點。
7、 2、實驗標(biāo)本的制備 抽取血清分別應(yīng)用速率法、電化學(xué)發(fā)光免疫法測定血清淀粉酶及C肽;取胰腺組織部分即刻按透視電鏡觀察胰腺組織超微結(jié)構(gòu)要求制片后行電鏡觀察,部分胰腺組織行組織學(xué)標(biāo)本制備,部分胰腺組織—80℃保存。 3、免疫組化 組織學(xué)標(biāo)本經(jīng)脫蠟、脫苯,水化后采用免疫組化法檢測FN膠原、ACT—A、ET—1、Integrinα5β1、JNK、a—SMA,結(jié)果判定:光鏡下胰腺間質(zhì)出現(xiàn)黃、棕色為陽性染色。免疫組化
8、半定量分析表達程度:應(yīng)用彩色圖象分析系統(tǒng),對各組大鼠胰腺切片隨機選取10個視野測量,計算陽性染色面積占胰腺視野面積比,并進行定量分析,以染色面積在標(biāo)本中所占百分比表示。 4、Masson膠原染色 組織學(xué)標(biāo)本經(jīng)脫蠟、脫苯,水化后采用采用Masson膠原染色法行胰腺組織膠原染色,結(jié)果判斷:胰腺腺泡呈紅色,膠原纖維呈藍色或綠色。膠原面積半定量分析:選取每一例標(biāo)本10個不同視野下相同大小的區(qū)域,測算出膠原面積占該區(qū)域的百分比,取
9、其平均值作為膠原的相對含量值。 5、RT-PCR RT-PCR技術(shù)檢測模型組激活素mRNA、整合素mRNA、內(nèi)皮素mRNA的表達。實驗所用物品的去Rnase處理,組織總RNA的提取,逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng),聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),基因擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,拍照。結(jié)果分析:將凝膠電泳圖像輸入,自動電泳凝膠成像分析系統(tǒng),進行表達強度分析,按下公式計算相對系數(shù):相對系數(shù)=細胞因子表達強度/β—actin表達強度。每
10、張電泳圖重復(fù)進行3次,計算均數(shù)。 6、western blot(蛋白印跡) western blot法檢測α—SMA、JNK表達。組織中總蛋白的提取,聚丙稀酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,轉(zhuǎn)膜,印跡(blotting),將膠片圖像輸入凝膠成像分析系統(tǒng),進行表達強度分析,按下公式計算相對系數(shù):相對系數(shù)=蛋白表達強度/β—actin表達強度,每張圖像重復(fù)進行3次,計算均數(shù)。 結(jié)論: 1、膽胰管內(nèi)注射2%T
11、NBS乙醇PBS溶液的方法成功復(fù)制慢性胰腺炎的動物模型。 2、本方法可反映急性胰腺炎向慢性胰腺炎轉(zhuǎn)化的動態(tài)過程,符合人類慢性胰腺炎病情演變的規(guī)律。本方法造模后4周,即可滿足研究需要。 3、激活素、整合素、內(nèi)皮素可促進慢性胰腺炎發(fā)生纖維化過程。 4、激活素促慢性胰腺炎胰腺纖維化的作用主要發(fā)生在病程的后期,整合素、內(nèi)皮素促慢性胰腺炎胰腺纖維化的作用主要發(fā)生在病程的早、中期。 5、漢丹肝樂具有抑制大鼠慢性胰腺炎
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