激活素整合素內(nèi)皮素在慢性胰腺炎胰腺纖維化機(jī)制中的作用及其對(duì)策的研究.pdf

1、胰腺纖維化是與慢性胰腺炎(chronic pancreatitis)相伴隨的特殊的組織病理學(xué)特點(diǎn)，往往導(dǎo)致胰腺功能性組織喪失，富含連接組織的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix ECM)在胰腺內(nèi)沉積等后果。然迄今為止，胰腺纖維化過(guò)程精確的調(diào)控機(jī)制仍未明了。 胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic Stellate cell，PSC)是產(chǎn)生胰腺纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞，并最終導(dǎo)致慢性胰腺炎的形成。在此過(guò)程中有多種細(xì)胞因子參與，

2、而各種因子的產(chǎn)生途徑、相互作用機(jī)制不盡相同。激活素(Activin)最早是在性腺發(fā)現(xiàn)的糖蛋白激素，后來(lái)發(fā)現(xiàn)其作用不僅限于性腺，具有多種生物學(xué)功能，屬于TGF-β超家族的成員，其三種受體屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。激活素參與機(jī)體炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)過(guò)程，一定水平激活素不但呈劑量依賴(lài)性的促進(jìn)PSC增殖并表達(dá)a平滑肌肌動(dòng)蛋白(a—SMA)，而且可增強(qiáng)其膠原蛋白分泌。內(nèi)皮素(endothelin ET)作為迄今所知最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)，其作用機(jī)制是通

3、過(guò)增加PSC的膠原合成和分泌，以及提高PSC的攝取與合成能力有關(guān)。整合素(Integrin)是位于細(xì)胞表面的糖蛋白受體家族分子，為介導(dǎo)細(xì)胞—細(xì)胞以及細(xì)胞—細(xì)胞外基質(zhì)，且作為介導(dǎo)信號(hào)傳遞的膜分子，在許多重要的病理生理過(guò)程：如細(xì)胞增殖、分化、伸展和遷移、凋亡、炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等中起著十分重要的作用。 細(xì)胞因子在促進(jìn)PSC活化、增殖、遷徙過(guò)程中，都要通過(guò)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)PSC進(jìn)行控制。C—Jun氨基端激酶(c—Jun

4、-Terminal kinase，JNK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen—activaed proren kinase，MAPK)信號(hào)傳導(dǎo)通路家族成員。MAPK廣泛參與細(xì)胞的多種生命過(guò)程，包括生長(zhǎng)、分化、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，腫瘤發(fā)生，細(xì)胞凋亡等。JNK主要參與ECM的合成。 漢丹肝樂(lè)是在臨床辯證的基礎(chǔ)上，以丹參、黃芪、漢防己堿、銀杏、赤芍等五味中藥組方而成。已有的研究證實(shí)，它可通過(guò)減輕肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化、保護(hù)肝細(xì)胞、抑制HSC增殖

5、及膠原合成、提高膠原酶活性、并促進(jìn)膠原蛋白降解等多種機(jī)制，來(lái)發(fā)揮抗肝纖維化效應(yīng)。 本課題采用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)(包括免疫組化、RT-PCR，western blot等)，檢測(cè)激活素、整合素、內(nèi)皮素在胰腺組織損傷修復(fù)及纖維化形成過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化以及應(yīng)用藥物干預(yù)胰腺纖維化的形成。旨在探討激活素、整合素、內(nèi)皮素在慢性胰腺炎胰腺纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用和細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)途徑以及藥物干預(yù)效果。本課題主要分為三部分：(1)慢性胰腺炎大鼠模

6、型的建立；(2)激活素、整合素、內(nèi)皮素在慢性胰腺炎胰腺組織中的表達(dá)；(3)漢丹肝樂(lè)對(duì)大鼠慢性胰腺炎胰腺纖維化干預(yù)的研究。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立 通過(guò)向Wistar大鼠膽胰管輸注含2％—硝基苯磺酸(TNBS)的10％乙醇PBS溶液復(fù)制慢性胰腺炎動(dòng)物模型，在膽胰管中注射等量的10％乙醇PBS溶液復(fù)制對(duì)照組，干預(yù)組(模型組動(dòng)物)術(shù)后第三天給予口服漢丹肝樂(lè)，大鼠術(shù)后分1、2、3、4、5、6、7周等觀察時(shí)點(diǎn)。

7、 2、實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的制備 抽取血清分別應(yīng)用速率法、電化學(xué)發(fā)光免疫法測(cè)定血清淀粉酶及C肽；取胰腺組織部分即刻按透視電鏡觀察胰腺組織超微結(jié)構(gòu)要求制片后行電鏡觀察，部分胰腺組織行組織學(xué)標(biāo)本制備，部分胰腺組織—80℃保存。 3、免疫組化 組織學(xué)標(biāo)本經(jīng)脫蠟、脫苯，水化后采用免疫組化法檢測(cè)FN膠原、ACT—A、ET—1、Integrinα5β1、JNK、a—SMA，結(jié)果判定：光鏡下胰腺間質(zhì)出現(xiàn)黃、棕色為陽(yáng)性染色。免疫組化

8、半定量分析表達(dá)程度：應(yīng)用彩色圖象分析系統(tǒng)，對(duì)各組大鼠胰腺切片隨機(jī)選取10個(gè)視野測(cè)量，計(jì)算陽(yáng)性染色面積占胰腺視野面積比，并進(jìn)行定量分析，以染色面積在標(biāo)本中所占百分比表示。 4、Masson膠原染色 組織學(xué)標(biāo)本經(jīng)脫蠟、脫苯，水化后采用采用Masson膠原染色法行胰腺組織膠原染色，結(jié)果判斷：胰腺腺泡呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色或綠色。膠原面積半定量分析：選取每一例標(biāo)本10個(gè)不同視野下相同大小的區(qū)域，測(cè)算出膠原面積占該區(qū)域的百分比，取

9、其平均值作為膠原的相對(duì)含量值。 5、RT-PCR RT-PCR技術(shù)檢測(cè)模型組激活素mRNA、整合素mRNA、內(nèi)皮素mRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)所用物品的去Rnase處理，組織總RNA的提取，逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，基因擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，拍照。結(jié)果分析：將凝膠電泳圖像輸入，自動(dòng)電泳凝膠成像分析系統(tǒng)，進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度分析，按下公式計(jì)算相對(duì)系數(shù)：相對(duì)系數(shù)=細(xì)胞因子表達(dá)強(qiáng)度/β—actin表達(dá)強(qiáng)度。每

10、張電泳圖重復(fù)進(jìn)行3次，計(jì)算均數(shù)。 6、western blot(蛋白印跡) western blot法檢測(cè)α—SMA、JNK表達(dá)。組織中總蛋白的提取，聚丙稀酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜，印跡(blotting)，將膠片圖像輸入凝膠成像分析系統(tǒng)，進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度分析，按下公式計(jì)算相對(duì)系數(shù)：相對(duì)系數(shù)=蛋白表達(dá)強(qiáng)度/β—actin表達(dá)強(qiáng)度，每張圖像重復(fù)進(jìn)行3次，計(jì)算均數(shù)。 結(jié)論： 1、膽胰管內(nèi)注射2％T

11、NBS乙醇PBS溶液的方法成功復(fù)制慢性胰腺炎的動(dòng)物模型。 2、本方法可反映急性胰腺炎向慢性胰腺炎轉(zhuǎn)化的動(dòng)態(tài)過(guò)程，符合人類(lèi)慢性胰腺炎病情演變的規(guī)律。本方法造模后4周，即可滿足研究需要。 3、激活素、整合素、內(nèi)皮素可促進(jìn)慢性胰腺炎發(fā)生纖維化過(guò)程。 4、激活素促慢性胰腺炎胰腺纖維化的作用主要發(fā)生在病程的后期，整合素、內(nèi)皮素促慢性胰腺炎胰腺纖維化的作用主要發(fā)生在病程的早、中期。 5、漢丹肝樂(lè)具有抑制大鼠慢性胰腺炎