整合素ανβ6調(diào)控胰腺癌惡性進(jìn)展的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和意義
　　 整合素是細(xì)胞表面黏附分子家族成員,介導(dǎo)細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的黏附反應(yīng),影響細(xì)胞基因的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞,調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生物學(xué)行為。其中αvβ6是一種特殊類型的整合素亞型,在正常上皮組織、上皮良性腫瘤組織中不表達(dá),在多種惡性上皮源性腫瘤組織中誘導(dǎo)表達(dá),在腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要調(diào)控作用。目前在口腔、皮膚鱗癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、卵巢及宮頸癌中均發(fā)現(xiàn)αvβ6高表達(dá),在結(jié)腸癌領(lǐng)

2、域?qū)Ζ羦β6的研究更為深入細(xì)致。前期研究表明:通過轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)表達(dá)αvβ6整合素,可使結(jié)腸癌細(xì)胞分泌MMP-9增多,加速破壞細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移。β6鏈胞內(nèi)功能段與細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)之間具有生理性直接連接。αvβ6在結(jié)腸癌標(biāo)本侵襲邊緣高表達(dá),在腫瘤內(nèi)部低表達(dá),作為影響結(jié)腸癌預(yù)后的重要危險(xiǎn)因子,與結(jié)腸癌進(jìn)展密切相關(guān)。但是整合素αvβ6對(duì)胰腺癌惡性生物學(xué)行為、化療耐藥及預(yù)后的影響,目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。
　　 胰腺

3、癌是預(yù)后最差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,由于它的高侵襲性和高轉(zhuǎn)移率,使80％以上的病人就診時(shí)已失去了根治性切除的機(jī)會(huì),而且胰腺癌對(duì)現(xiàn)有的化療、放療及免疫治療均不敏感。在過去20年中胰腺癌5年生存率無顯著變化,仍在5％以下。探討整合素αvβ6對(duì)胰腺癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡、化療耐藥及預(yù)后的影響,有助于深入理解胰腺癌惡性進(jìn)展的分子生物學(xué)機(jī)制,以αvβ6為靶點(diǎn)進(jìn)行高效無毒的靶向治療,對(duì)于提高胰腺癌的療效及改善預(yù)后將起到重要的促進(jìn)作用。
　　

4、 第一部分整合素αvβ6在胰腺癌組織中的表達(dá)及對(duì)預(yù)后的影響
　　 目的：研究整合素αvβ6及其相關(guān)因子TGF-β1在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的表達(dá)情況,與臨床病理特征間的關(guān)系及對(duì)患者預(yù)后的影響。
　　 方法選擇92例胰腺導(dǎo)管腺癌病人的手術(shù)病理標(biāo)本,10例尸解正常胰腺組織作為對(duì)照,制作組織芯片；免疫組化染色檢測(cè)αvβ6、TGF-β1在胰腺癌組織中的表達(dá)情況；回顧性分析病人的臨床病理資料并隨訪生存情況,探討整合素αvβ6、TGF

5、-β1在胰腺癌中的表達(dá)情況及其相關(guān)性,與臨床病理特征之間的關(guān)系；通過生存分析,判斷其表達(dá)高低對(duì)患者預(yù)后的影響。
　　 結(jié)果：整合素αvβ6在正常胰腺組織中不表達(dá),在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中的陽性表達(dá)率為56.5％,其表達(dá)高低與腫瘤大小(P=0.041),TNM分期P=0.027)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.030)成正相關(guān)。TGF-β1在胰腺癌組織中的陽性表達(dá)率為66.3％,其表達(dá)高低與腫瘤分化不良及TNM分期密切相關(guān)。Spearman相關(guān)

6、檢驗(yàn)證實(shí)αvβ6與TGF-β1在胰腺癌中的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。Kaplan-Meier生存曲線顯示αvβ6高表達(dá)的病人中位生存時(shí)間較αvβ6低表達(dá)的病人明顯縮短(P=0.001),單變量及多變量生存分析顯示整合素αvβ6是影響胰腺癌預(yù)后的獨(dú)立不良指標(biāo)。
　　 結(jié)論：整合素αvβ6在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)并與TGF-β1的表達(dá)情況成正相關(guān),是影響病人預(yù)后的一種重要危險(xiǎn)因素。
　　 意義揭示了整合素αvβ6和TGF-β1

7、在胰腺癌組織中的表達(dá)情況及其相關(guān)性,與各臨床病理特征之間的關(guān)系；首次證實(shí)整合素αvβ6是影響胰腺癌預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立不良指標(biāo),為更好地判斷患者預(yù)后并以αvβ6作為靶點(diǎn)對(duì)胰腺癌進(jìn)行靶向治療提供了實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。
　　 第二部分整合素αvβ6對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響
　　 目的：研究整合素αvβ6在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況及對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　 方法選取三種胰腺腺癌細(xì)胞系,RT-PCR、流式細(xì)

8、胞術(shù)檢測(cè)整合素αvβ6在這三種細(xì)胞中的表達(dá)高低；選取αvβ6高表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞,應(yīng)用針對(duì)αvβ6的功能性阻斷單抗10D5封閉細(xì)胞中αvβ6的功能后,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化；Transwell侵襲小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的變化；明膠酶譜及蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞MMP-9分泌水平的變化；通過比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間各組數(shù)據(jù)的差異,分析整合素αvβ6所起的重要作用。
　　 結(jié)果： RT-PCR及流式細(xì)胞檢測(cè)從轉(zhuǎn)錄及蛋白水平證實(shí)整合素α

9、vβ6在胰腺癌細(xì)胞系PANC-1中高表達(dá),在Capan-2中較高表達(dá),在CFPAC-1中低表達(dá)；選取PANC-1及Capan-2細(xì)胞應(yīng)用10D5封閉細(xì)胞中αvβ6的功能后,細(xì)胞增殖率僅為對(duì)照組細(xì)胞的(61.94±3.62)％和(67.35±5.02)％；侵襲細(xì)胞數(shù)目由71±9/FIP,36±6/HP分別減少到19±5/HP,13±4/HP；如先用抗MMP-9的單抗Ab-1預(yù)處理細(xì)胞,則各組的侵襲細(xì)胞數(shù)減少到相似的水平(20±4/HP,1

10、2±5/HP),提示胰腺癌細(xì)胞通過重建基底膜的侵襲能力是由整合素αvβ6介導(dǎo)的,并依賴于MMP-9的活性；明膠酶譜及蛋白印跡結(jié)果顯示阻斷細(xì)胞中αvβ6的功能后,PANC-1及Capan-2細(xì)胞的MMP-9分泌量分別減少到對(duì)照組細(xì)胞的(9.28±3.11)％和(6.35±2.46)％。
　　 結(jié)論：整合素αvβ6對(duì)胰腺癌細(xì)胞的體外增殖、侵襲及MMP-9分泌水平起著重要的促進(jìn)作用。阻斷了細(xì)胞中αvβ6的功能,就可以顯著抑制細(xì)胞的增殖

11、、侵襲能力及轉(zhuǎn)移潛能。
　　 意義首次檢測(cè)了整合素αvβ6在不同胰腺癌細(xì)胞系的表達(dá)情況,揭示了αvβ6在胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中的重要作用,為針對(duì)αvβ6通過單克隆抗體對(duì)胰腺癌進(jìn)行靶向治療提供了確切的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第三部分整合素αvβ6對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡及化療敏感性的影響
　　 目的：研究整合素αvβ6在胰腺癌細(xì)胞凋亡及化療敏感性中所起的重要作用
　　 方法構(gòu)建針對(duì)αvβ6的小片段干擾RNA(s

12、mall interfering RNA,siRNA),選取干擾效率最強(qiáng)的αvβ6 siRNA,采用脂質(zhì)體2000將其轉(zhuǎn)染入胰腺癌細(xì)胞PANC-1,無效干擾片段RNA轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照；RT-PCR、Western Blotting檢測(cè)細(xì)胞中αvβ6表達(dá)的沉默效果；MMT法檢測(cè)細(xì)胞增殖狀態(tài)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡,Annexin V-FITC試劑盒測(cè)定細(xì)胞凋亡率的變化；以吉西他濱為化療藥物,檢測(cè)抑制αvβ6表達(dá)后胰腺癌細(xì)胞化療

13、敏感性及凋亡改變；應(yīng)用Caspase-3檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性的變化；通過建立BALB/c裸鼠胰腺癌皮下種植瘤模型,比較各組細(xì)胞的成瘤能力及αvβ6對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。
　　 結(jié)果：αvβ6 siRNA轉(zhuǎn)染入PANC-1細(xì)胞后48小時(shí),細(xì)胞內(nèi)αvβ6的表達(dá)在mRNA和蛋白水平均被顯著抑制,并持續(xù)到轉(zhuǎn)染后96小時(shí)。沉默αvβ6表達(dá)后PANC-1細(xì)胞呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的增殖抑制；轉(zhuǎn)染后96小時(shí),有41％的PANC-1細(xì)

14、胞阻滯在G2/M期,細(xì)胞凋亡率升高到13.5±2.3％；吉西他濱可以誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡,應(yīng)用siRNA沉默αvβ6表達(dá)可以提高細(xì)胞對(duì)吉西他濱的化療敏感性,增強(qiáng)吉西他濱誘導(dǎo)的Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。成瘤實(shí)驗(yàn)見αvβ6 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞形成肉眼可見的腫瘤時(shí)間平均為(15±4.6)d,較對(duì)照組(9±2.7)d明顯延長(zhǎng)。種植后6周,αvβ6 siRNA轉(zhuǎn)染組形成腫瘤的平均體積較陰性轉(zhuǎn)染組明顯縮小(170±32mm3vs760

15、±48mm3,P<0.01)。
　　 結(jié)論：整合素αvβ6在抑制胰腺癌細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)吉西他濱化療耐藥性中起著重要作用,通過RNA干擾沉默αvβ6表達(dá)可以顯著抑制胰腺癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖,引起細(xì)胞周期G2/M阻滯,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)吉西他濱化療敏感性。整合素αvβ6作為胰腺癌靶向治療新的潛在靶點(diǎn),有著廣闊的臨床應(yīng)用前景。
　　 意義首次構(gòu)建了靶向αvβ6基因的小干擾RNA并將其成功轉(zhuǎn)染入PANC-1胰腺癌細(xì)胞,結(jié)果顯著抑制了胰