七十味珍珠丸對(duì)苯妥英鈉造成大鼠頂葉、海馬神經(jīng)元凋亡的影響及Bcl-2、Bax的表達(dá).pdf

1、目的:癲癇，一種古老的常見疾病，是由腦部神經(jīng)元的高度同步化異常放電所致的慢性腦部疾病。臨床治療中對(duì)于無明確病因或雖有病因卻不能根治者仍主要考慮抗癲癇藥物（Antiepilepticdrugs，AEDs）治療。在眾多AEDs中，苯妥英鈉(PhenytoinSodium，PHT)由于其半衰期長、無鎮(zhèn)靜副作用、價(jià)格低廉等原因仍作為多種癲癇類型治療首選藥物之一。但由于其治療譜狹[1]（約10-20ug/ml）且個(gè)體差異性大，故在臨床治療中極易出

2、現(xiàn)多個(gè)系統(tǒng)的毒副作用。在神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)中主要表現(xiàn)在小腦前庭功能障礙、周圍神經(jīng)系統(tǒng)損害、錐體外系功能障礙、PHT腦病、高顱壓、意識(shí)障礙、植物神經(jīng)功能紊亂等多個(gè)方面[2]。同時(shí)藏藥七十味珍珠丸（Rannasangpei，RNSP）由于其具有鎮(zhèn)靜抗驚厥，促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)保護(hù)，降低腦損傷后NA、β-EP、5-HT神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生等作用[3]故臨床上常用于與AEDs協(xié)同治療癲癇。而本實(shí)驗(yàn)旨在通過研究PHT、RNSP與大鼠頂葉、海馬神經(jīng)元凋亡的相關(guān)性來

3、進(jìn)一步了解PHT的神經(jīng)毒副作用及RNSP對(duì)PHT作用后的神經(jīng)元是否產(chǎn)生影響。具體是通過原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（terminaldeoxynucleotidyltransferse-mediatedbiotinylateddeoxyuridinetriphosphatenickelendlabeling，TUNEL）來檢測各組頂葉、海馬神經(jīng)元的凋亡及用免疫組化檢測各組Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)水平。
　　 方法:
　　

4、1分組及給藥:取健康雄性10周齡左右SD(Sprague-Dawley)大鼠40只，實(shí)驗(yàn)大鼠級(jí)別為清潔級(jí)，重量約200±20g，根據(jù)給藥不同隨機(jī)分為NS（生理鹽水）組、RNSP組、PHT組及PHT+RNSP混合組4組，每組10只大鼠:再根據(jù)時(shí)間因素10天、20天分為2個(gè)亞組，每個(gè)亞組5只大鼠。給藥劑量為成人單位體重常規(guī)治療量25倍，具體為NS1ml/100g/d，PHT150mg/kg/d，RNSP250mg/kg/d;方式為一天兩次灌

5、胃器灌胃，分別灌胃10天、20天。
　　 2取材及檢測:取各組大鼠予以水合氯醛腹腔麻醉后，剪開胸腔暴露心臟，灌注針由心尖入針經(jīng)左心室至主動(dòng)脈，NS沖洗多聚甲醛灌注后取腦組織頂葉、海馬置于多聚甲醛中浸泡固定，24小時(shí)后取標(biāo)本脫水透明包埋切片。通過TUNEL檢測各組凋亡神經(jīng)元凋亡情況并以細(xì)胞凋亡率表示各組結(jié)果;通過免疫組化檢測各組神經(jīng)元Bcl-2、Bax蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)情況并以AO值表示各組結(jié)果。
　　 3統(tǒng)計(jì)分析:通過SP

6、SS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，本實(shí)驗(yàn)為完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的多個(gè)樣本均數(shù)比較可使用方差分析，組間均數(shù)比較可使用Dunnett-t檢驗(yàn)或SNK-q檢驗(yàn)，Bcl-2蛋白與Bax蛋白間相關(guān)性檢測可用直線相關(guān)分析方法。
　　 結(jié)果:
　　 1、各實(shí)驗(yàn)組中大鼠頂葉神經(jīng)元的凋亡情況:
　　 1.1HE染色:
　　 各藥物組大鼠頂葉皮質(zhì)神經(jīng)元排列較整齊，僅可見少數(shù)凋亡細(xì)胞，呈胞膜皺縮、胞核固縮深染、染色質(zhì)邊集及周圍空泡

7、形成。與NS組比較形態(tài)上無明顯差異。
　　 1.2TUNEL結(jié)果:
　　 NS組可見少數(shù)凋亡細(xì)胞，胞核固縮其內(nèi)出現(xiàn)褐色顆?；驁F(tuán)塊;RNSP組、PHT組、PHT+RNSP混合組可見散在分布凋亡細(xì)胞，將組間均數(shù)進(jìn)行兩兩比較尸值＞0.01，表示各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 1.3Bcl-2及Bax蛋白表達(dá):
　　 Bcl-2蛋白為抗凋亡蛋白，陽性細(xì)胞表達(dá)為胞漿核膜出現(xiàn)棕黃色顆粒，呈重染:B;x蛋白為促凋亡蛋白

8、，陽性細(xì)胞表達(dá)為胞漿呈黃褐色。通過統(tǒng)計(jì)標(biāo)本陽性細(xì)胞的平均光密度值即AO值進(jìn)行組間兩兩比較尸值＞0.01，表示各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、各實(shí)驗(yàn)組中大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡情況:
　　 2.1HE染色:
　　 NS組大鼠海馬神經(jīng)元排列整齊，細(xì)胞輪廓清晰，胞漿紅染胞核藍(lán)染，可見少數(shù)凋亡細(xì)胞，呈胞膜皺縮、胞核固縮深染、染色質(zhì)邊集及周圍空泡形成。RNSP組僅可見散在分布的幾個(gè)凋亡細(xì)胞。PHT組凋亡細(xì)胞較多，呈神經(jīng)元排

9、列凌亂、胞間距增大、細(xì)胞輪廓模糊、胞核固縮深染及周圍空泡形成，其長療程亞組凋亡尤為明顯。PHT+RNSP組凋亡情況介于PHT組、RNSP組之間。
　　 2.2TUNEL結(jié)果:
　　 NS組可見少數(shù)凋亡細(xì)胞，RNSP組可見散在分布凋亡細(xì)胞，將兩組均數(shù)進(jìn)行比較P值＞0.01，表示兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PHT組凋亡細(xì)胞明顯增多，以長療程PHT組為著;PHT+RNSP混合組凋亡情況一般，與NS組一起進(jìn)行多樣本均數(shù)兩兩比較均為P

10、＜0.01，表示各組間存在明顯差異。
　　 2.3Bcl-2及Bax蛋白表達(dá):
　　 在Bax蛋白表達(dá)中，NS組、RNSP組可見少數(shù)表達(dá)陽性細(xì)胞;PHT+RNSP組表達(dá)陽性細(xì)胞增多;PHT組表達(dá)陽性細(xì)胞最多及著色最強(qiáng)，長療程亞組尤為顯著。在Bcl-2蛋白表達(dá)中，各組情況與前述恰好相反。統(tǒng)計(jì)各組間陽性細(xì)胞AO值并進(jìn)行兩兩比較，NS組與RNSP組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，余各組間均存在明顯差異。
　　 3、Bcl-2蛋白與

11、Bax蛋白相關(guān)性:
　　 在實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬神經(jīng)元中Bcl-2蛋白與Bax蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1、PHT、RNSP及PHT+RNSP組在長短療程因素參與下對(duì)正常大鼠頂葉皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)未產(chǎn)生明顯影響。
　　 2、RNSP組中長短療程亞組對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)均未產(chǎn)生影響:PHT組可明顯引起海馬神經(jīng)元凋亡，Bcl-2蛋白表達(dá)減少，