苯妥英鈉對大鼠額葉和小腦神經(jīng)細胞凋亡及Bcl-2、Bax表達的影響.pdf

1、目的：苯妥英鈉(PTH)系二苯乙內(nèi)酰脲類鈉鹽，是迄今應用最廣泛且有效的控制癲癇發(fā)作的藥物之一。但由于其安全血藥濃度范圍窄，血中治療濃度與中毒濃度接近，血藥濃度在常用劑量下個體差異較大，極易出現(xiàn)毒性反應。PTH的不良反應涉及多個系統(tǒng)，主要表現(xiàn)于神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、內(nèi)分泌和淋巴系統(tǒng)反應，以及其他的一些毒性反應，而其神經(jīng)系統(tǒng)不良反應主要表現(xiàn)為小腦前庭功能障礙、錐體外系功能障礙及認知功能損害。PTH中毒可因給藥途徑、用藥劑量和用藥療程不同表現(xiàn)為

2、急性中毒和慢性中毒，臨床上急慢性中毒的病例報道多見。其不良反應可能與其影響細胞凋亡有關，但癲癇本身亦能引起細胞凋亡。本實驗旨在研究PTH對正常大鼠的影響，按用藥劑量及用藥療程的不同進行分組，用DNA原位末端標記法(terminal deoxynucleotidyl transferse-mediated biotinylated deoxyuridine triphosphate nickel end labeling, TUNEL)檢

3、測額葉皮層和小腦神經(jīng)細胞凋亡，應用免疫組化法檢測額葉皮層和小腦神經(jīng)細胞Bax和Bcl-2表達的變化，觀察PTH不良反應與神經(jīng)細胞凋亡以及Bax和Bcl-2表達的關系。
　　 方法：
　　 1 分組：健康雄性70日齡(Sprague-Dawley,SD)大鼠30只（體重200±20g）。按照隨機分組原則將其分為3組，分別為A組正常生理鹽水組(n=10)，B組低劑量苯妥英鈉組(n=10)，C組高劑量苯妥英鈉組(n=10)，各

4、組再按療程分為15天組(n=5)和30天組(n=5)。
　　 2 藥物干預：采用自制灌胃針進行灌胃。低劑量組每日總劑量按成人單位體重治療劑量的25倍計算，PHT約100mg/kg/d，高劑量組按成人單位體重中毒劑量的25倍計算，PHT約200mg/kg/d，生理鹽水組給予等劑量的生理鹽水，在9:00-11:00Am進行灌胃，低劑量、高劑量及生理鹽水分別灌胃15天和30天。
　　 3 動物取材：各組大鼠在深度麻醉下用生理鹽

5、水、4％多聚甲醛溶液經(jīng)左心室、主動脈灌注，取腦組織，將其放置在蠟板上，用刀片在視交叉和乳頭體處垂直橫斷腦組織后，取前段作為額葉(厚約4mm)，再取小腦(厚約4mm)，迅速放入4％多聚甲醛溶液中固定后制作石蠟標本。24小時后進行石蠟包埋，常規(guī)切片做細胞凋亡檢測和免疫組化。
　　 4 神經(jīng)細胞凋亡的檢測：標本做成石蠟切片后，用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸缺口末端標記技術(terminal deoxynucleoti

6、dyl transferse-mediated biotinylated deoxyuridine triphosphate nickel end labeling technique， TUNEL)檢測額葉皮層及小腦凋亡的神經(jīng)細胞。
　　 5 Bcl-2和Bax陽性細胞的檢測：標本制作方法同上，用免疫組化方法檢測Bcl-2和Bax陽性細胞即標本做成石蠟切片后，經(jīng)抗原修復、山羊血清封閉后，加Bcl-2和Bax多克隆抗體，在經(jīng)二抗

7、、三抗孵育，DAB顯色后置顯微鏡下觀察陽性結果。
　　 1 PHT對大鼠額葉皮層和小腦神經(jīng)細胞凋亡影響的TUNEL檢測結果：
　　 額葉皮層神經(jīng)細胞低劑量15天組和30天組、高劑量15天組、高劑量30天組和正常對照組偶見凋亡細胞。
　　 小腦神經(jīng)細胞正常對照組偶見凋亡細胞；低劑量15天組和30天組、高劑量15天和30天組凋亡細胞的數(shù)目增多，不同劑量間和不同療程之間均有顯著差異。
　　 2 PHT對大鼠額葉

8、皮層神經(jīng)細胞和小腦神經(jīng)細胞Bcl-2表達的影響
　　 2.1 PHT對大鼠額葉皮層神經(jīng)細胞Bcl-2表達的影響
　　 低劑量15天組和30天組皮層神經(jīng)細胞，高劑量15天組和30天組皮層神經(jīng)細胞Bcl-2陽性細胞較對照組無明顯差異；
　　 低劑量15天組和30天組小腦神經(jīng)細胞Bcl-2陽性細胞較正常對照組減少，陽性細胞著色和密度均減弱，不同療程兩組之間有顯著差異；
　　 高劑量15天組和30天組小腦神經(jīng)細胞

9、Bcl-2陽性細胞較低劑量組減少，有顯著性差異，陽性細胞著色和密度均減弱，不同療程兩組之間有顯著差異。
　　 3 PHT對大鼠額葉皮層神經(jīng)細胞和小腦神經(jīng)細胞Bax表達的影響
　　 3.1 PHT對大鼠額葉皮層神經(jīng)細胞Bax表達的影響
　　 低劑量15天組和30天組皮層神經(jīng)細胞有散在的Bax陽性細胞：高劑量15天組和30天組皮層神經(jīng)細胞亦有散在的Bax陽性細胞，較正常對照組無明顯變化。
　　 3.2 PHT

10、對大鼠小腦神經(jīng)細胞Bax表達的影響
　　 低劑量15天組和30天組小腦神經(jīng)細胞Bax陽性細胞較正常對照組增多，陽性細胞著色和密度均增強，不同療程兩組之間有顯著差異；
　　 高劑量15天組和30天組小腦神經(jīng)細胞Bax陽性細胞較低劑量組增多，有顯著性差異，陽性細胞著色和密度均增強，不同療程兩組之間有顯著差異；
　　 結論：
　　 1 苯妥英鈉在劑量和用藥療程不同的情況下，對成年大鼠額葉皮層神經(jīng)細胞的凋亡及Bc