順鉑在喉癌腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞中的機(jī)制研究.pdf

1、喉癌是喉部最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率目前有明顯增長趨勢,占全身惡性腫瘤的5.7％一7.6%[1],發(fā)病機(jī)理目前仍存在許多假說,一般認(rèn)為與吸煙、飲酒、空氣污染、病毒感染和性激素及受體有關(guān)。雖然近年隨著微創(chuàng)手術(shù)、放療、化療、同步放化療及生物治療等綜合性治療措施改進(jìn)以及共同應(yīng)用,已使患者的生存時間及生活質(zhì)量有所提高，但喉癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及對放化療不敏感常使治療效果欠佳。越來越多的研究表明，這可能與腫瘤干細(xì)胞有關(guān)。
　　腫瘤干細(xì)胞（Canc

2、er stem cells,CSCs）學(xué)說認(rèn)為:腫瘤組織中存在極少量充當(dāng)干細(xì)胞角色的腫瘤細(xì)胞,它們具有自我更新和多向分化潛能,在腫瘤的形成和生長中起著重要作用,是腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。側(cè)群細(xì)胞（side population，SP）分析法作為腫瘤干細(xì)胞分離鑒定的一種方法，主要是利用干細(xì)胞能夠?qū)晒馊玖?H oechst33342外排的特性,經(jīng)過紫外激發(fā)后用雙波長(450nm和675nm以上波長)監(jiān)測,可以觀察到這群細(xì)胞發(fā)出微弱的藍(lán)

3、色和紅色熒光,在流式二維分析點(diǎn)陣圖上,呈彗星狀分布在陽性染色的主群(main population,MP或者non-SP)細(xì)胞的一側(cè)[1,2]。
　　第一部分喉癌側(cè)群細(xì)胞分選的條件優(yōu)化
　　目的: 探討喉癌細(xì)胞株Hep-2中側(cè)群細(xì)胞（side population，SP）分選的優(yōu)化條件。
　　方法: 取對數(shù)生長期的Hep-2細(xì)胞，予胰酶消化后，用含2%胎牛血清1640培養(yǎng)基制成1×106個/ml單細(xì)胞懸液。①實(shí)驗(yàn)組喉癌

4、細(xì)胞懸液中加入Hoechst33342至終濃度分別為5μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml，于37℃中孵育90min。②取單細(xì)胞懸液，分別于37°水浴中孵育 Hoechst50、70、90、110、130min。③實(shí)驗(yàn)組喉癌細(xì)胞懸液加入Hoechst后，分別孵育于37°水浴及37°恒溫箱中。兩組保持Hoechst濃度及細(xì)胞密度一致。④取匯合度分別為100%、70%的兩瓶細(xì)胞，同上制成單細(xì)胞懸液。分別加入相同濃度的Ho

5、echst，并于37°水浴。染色結(jié)束于冰上終止染色5min后，離心，去上清，加入PBS重懸細(xì)胞，且均于上機(jī)前5min加入碘化丙啶（PI）至1μg/ml，后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測鑒定。以上各組均設(shè)陰性組于Hoechst染色前加維拉帕米，至終濃度為150μmol/ml，并于37℃中孵育30min后，其他各條件保持與相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組一致。
　　結(jié)果: ①當(dāng)Hoechst33342濃度分別為5μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/m

6、l時， SP%分別為（39.96±0.240）%、（26.23±0.385）%、（18.79±0.023）%、（19.01±0.138）%，死細(xì)胞比例分別為（30.45±0.634)%、(49.9±0.42)%、(50.12±0.68)%、(64.16±0.387)%。②Hoechst在37°水浴中孵育90min時，流式細(xì)胞圖形最典型，SP%為(17.37±1.423）%；③孵育于37°水浴較孵育恒溫箱中，實(shí)驗(yàn)組未被Hoechst333

7、42標(biāo)記的細(xì)胞分別為（18.67±0.448）%、（22.6±0.497）%；④匯合度90%以上較匯合度70%的細(xì)胞，SP%由（19.075±0.464)%降到（16.073±0.519)%。以上結(jié)果均經(jīng)SPSS16.0分析，p<0.05，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論: 在流式細(xì)胞儀分選喉癌Hep-2側(cè)群細(xì)胞中Hoechst33342的最佳濃度為10μg/ml，最佳孵育時間為90min，且水浴優(yōu)于恒溫箱中孵育，細(xì)胞密度最好選擇80

8、-90%之間。
　　第二部分喉癌側(cè)群細(xì)胞的分選及其體外生物學(xué)特性
　　目的: 探討喉癌細(xì)胞株Hep-2中干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞（side population,SP）的分選方法及側(cè)群細(xì)胞的干細(xì)胞特性。
　　方法: 制備喉癌Hep-2單細(xì)胞懸液，經(jīng)Hoechst33342染色后，用熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)分選出人喉癌側(cè)群和非側(cè)群(non-SP,NSP)細(xì)胞，測定 SP細(xì)胞亞群所占的比例。電子顯微鏡下觀察SP及NSP細(xì)胞形態(tài)，檢測兩

9、群細(xì)胞的細(xì)胞周期、CCK8檢測細(xì)胞的增殖能力。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測SP及NSP細(xì)胞中的ABCG2 mRNA的相對量，結(jié)果用2-Δ(ΔCt)計(jì)算。
　　結(jié)果: 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明，SP細(xì)胞在Hep-2細(xì)胞株中占(13.17±1.85)％.生長曲線（CCK8法）示，SP細(xì)胞較NSP細(xì)胞有更強(qiáng)的增殖能力；兩者所處的細(xì)胞周期相似，S期細(xì)胞比例及增殖指數(shù)(proliferation index，PI）兩者相比，t分別

10、為0．678、0．614(p<0.05)。RT-PCR示SP中ABCG2 mRNA含量高于NSP。
　　結(jié)論: 人Hep-2細(xì)胞株中存在一部分能將Hoechst33342排出的側(cè)群細(xì)胞。SP細(xì)胞較NSP有更強(qiáng)的體外增殖能力，具有干細(xì)胞活性。SP細(xì)胞中ABCG2 mRNA表達(dá)量明顯高于NSP細(xì)胞。
　　第三部分順鉑在喉癌非側(cè)群細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞中作用的探討
　　目的: 探討喉癌細(xì)胞株Hep2經(jīng)流式分選后的非側(cè)群細(xì)

11、胞經(jīng)化療藥物誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變?yōu)楦杉?xì)胞樣腫瘤細(xì)胞的可能機(jī)制。
　　方法: 喉癌 Hep2細(xì)胞株經(jīng)流式細(xì)胞儀熒光活化細(xì)胞分選系統(tǒng)（fluorescence-actived cell sortin,FACS）分選后，獲得的非側(cè)群待貼壁80%后分別加入順鉑（實(shí)驗(yàn)組）和生理鹽水(對照組)培養(yǎng)48h，再次上流式細(xì)胞儀檢測兩組側(cè)群細(xì)胞比例;并通過熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及western blot分別在mRNA和蛋白水平檢測兩組細(xì)胞的干細(xì)胞樣

12、標(biāo)記β-catenin、notch-1的基因和蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果: 實(shí)驗(yàn)組非側(cè)群細(xì)胞經(jīng)順鉑（終濃度1ug/ml）作用48h后，側(cè)群細(xì)胞比例為(17.16±0.18)%，對照組則為(10.05±1.20)%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.844，P=0.004）。熒光定量 RT-PCR示經(jīng)順鉑處理實(shí)驗(yàn)組的β-catenin、notch-1 mRNA較對照組顯著增多；western blot示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中β-catenin、n