人參皂甙Rd減輕缺血-再灌注心肌損傷及其抗凋亡機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　氧化應(yīng)激(oxidative stress)是心肌缺血/再灌注(MI/R)損傷的中心環(huán)節(jié),MI/R過程中產(chǎn)生大量活性氧族(ROS)可直接或間接影響心臟功能,促使心肌細(xì)胞凋亡和壞死。線粒體既是內(nèi)源性ROS(包括超氧陰離子,過氧化氫,過氧亞硝酸鹽和羥基自由基)產(chǎn)生的主要來源又是其作用靶點(diǎn)。線粒體功能障礙將導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加,加劇氧化劑誘導(dǎo)的凋亡。再灌注早期,ROS爆發(fā)會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài),引起線粒體內(nèi)膜電位變化,

2、從而促使線粒體細(xì)胞色素C釋放入胞質(zhì),最終激活凋亡執(zhí)行分子caspase-3,引發(fā)細(xì)胞凋亡。因此阻止組織和細(xì)胞內(nèi)ROS的過量產(chǎn)生和維持線粒體的完整性是對(duì)抗MI/R損傷的有效手段。
　　中國傳統(tǒng)藥用植物人參中提取的活性單體成分——人參皂甙Rd(Ginsenoside Rd,GSRd),以其高親脂、易通過生物膜和獨(dú)特的藥理學(xué)作用備受關(guān)注。研究表明GSRd可以抑制ROS生成,修復(fù)受損的自由基清除系統(tǒng),具有抗氧化作用。我們的研究組前期研究發(fā)

3、現(xiàn) GSRd在治療短暫局灶性腦缺血損傷中發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用。因此,我們推測(cè)GSRd在MI/R損傷中可能會(huì)有心肌保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究旨在明確GSRd對(duì)缺血心臟是否具有心肌保護(hù)作用及其主要機(jī)制,以期為GSRd有效、合理應(yīng)用于臨床治療急性MI/R及相關(guān)疾病提供理論依據(jù)和參考資料。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　1.探討GSRd是否可減輕MI/R損傷,對(duì)缺血/再灌注(I/R)心臟具有保護(hù)作用。
　　2.明確GSRd能否減少M(fèi)I/R誘

4、導(dǎo)的氧化應(yīng)激。
　　3.進(jìn)一步探究GSRd抗線粒體凋亡的主要機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):Sprague-Dawley雄性大鼠,常規(guī)建立大鼠急性MI/R(30 min/3 h)模型。將SD大鼠隨機(jī)分為3組(n=8):
　　1)假手術(shù)組(Sham):開胸,但不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈,于缺血開始前的30 min腹腔注射生理鹽水10 ml/kg;
　　2)模型組(MI/R):于缺血開始前的30 min腹腔注射生

5、理鹽水10 ml/kg,缺血30 min,再灌注3 h;
　　3)藥物組(MI/R+GSRd):于缺血開始前的30 min腹腔注射GSRd50 mg/kg,缺血30 min,再灌注3 h。
　　全程持續(xù)監(jiān)測(cè)血壓、心率及心臟功能;采用伊文氏蘭-TTC雙染法測(cè)定心肌梗死面積;采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP原位平端標(biāo)記法(TUNEL)原位檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡;利用分光光度計(jì)法測(cè)定血清乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)水平。

6、
　　2.離體實(shí)驗(yàn):原代分離培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞(NRC),給予缺氧/復(fù)氧(3 h/2 h)處理模擬缺血/再灌注(SI/R)。培養(yǎng)的NRC隨機(jī)分為4組:
　　1)常氧對(duì)照組(Control),Tyrode液孵育細(xì)胞,常規(guī)培養(yǎng)5 h;
　　2)模型組(SI/R),模擬缺血(SI)緩沖液孵育細(xì)胞,37℃缺氧小室培養(yǎng)3 h后,更換模擬再灌注(SR)緩沖液孵育細(xì)胞,常規(guī)培養(yǎng)2 h;
　　3)溶劑對(duì)照組(Vehicle),SI

7、/R開始前30 min給予0.2％(v/v)DMSO孵育細(xì)胞;
　　4)藥物組(SI/R+GSRd),SI/R開始前30 min給予GSRd(10μM)孵育細(xì)胞,該藥物劑量是根據(jù)前期劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上確定。
　　采用MTT檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率;通過檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)釋放分析心肌細(xì)胞損傷情況;采用Annexin V/PI雙染經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;利用熒光探針檢測(cè)心肌細(xì)胞ROS生成、線粒體膜電位;采用免疫印跡法檢測(cè)凋亡

8、線粒體途徑中細(xì)胞色素C,caspase-9,caspase-3,Bcl-2家族蛋白及P-Akt/P-GSK-3β蛋白的表達(dá)及磷酸化水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:各組間缺血前基礎(chǔ)水平(Baseline)的左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室最大上升/下降速率(±LVdP/dtmax)等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)無明顯差異;各處理組間心率(HR)和平均動(dòng)脈壓(MABP)亦無顯著差異。實(shí)驗(yàn)伊始至結(jié)

9、束的I0(缺血0 min)、I30(缺血30 min)、R60(再灌注60 min)及R180(再灌注180 min)各時(shí)間點(diǎn)上,MI/R組與Sham組相比LVSP及±LVdP/dtmax明顯降低(P<0.01),LVEDP顯著升高(P<0.01)。另一方面,MI/R+GSRd組上述時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)雖不及 Sham組;但與 MI/R組相比,MI/R+GSRd組能在 I0、I30、R60及 R180各時(shí)間點(diǎn)上明顯提高 LVSP和± LVdP/

10、dtmax(P<0.01)及顯著抑制 LVEDP(P<0.01),從而增強(qiáng)大鼠缺血后心臟功能恢復(fù)。提示 GSRd可以改善 MI/R心臟收縮/舒張功能,促進(jìn)再灌注心肌的功能恢復(fù)。
　　2.與Sham組相比,MI/R組大鼠心肌梗死面積,血清CK、LDH水平及心肌TUNEL陽性細(xì)胞和Caspase3活性均明顯增加。GSRd可顯著減少梗死面積(20.9%±2.3%vs.36.0%±1.5%MI/R-group,P<0.01,n=8),降低

11、CK、LDH水平(2,238±160 U/L and1,320±109 U/L vs.3,324±228 and2,327±143U/L respectively,P<0.01),減少TUNEL陽性細(xì)胞(11%±2.3% vs.16.3%±1.8%,P<0.01),降低Caspase-3活性(1.9±0.3 vs.3.0±0.2,P<0.05)。結(jié)果提示GSRd可減輕MI/R引起的心肌梗死、細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡,發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

12、　　3.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:GSRd(0.1-50μM)常規(guī)常氧孵育細(xì)胞24 h,各組間細(xì)胞存活率和LDH漏出率沒有顯著性差異,說明GSRd在該濃度范圍內(nèi)對(duì)心肌細(xì)胞是無毒安全的。與常氧對(duì)照組相比,缺氧3h復(fù)氧2h導(dǎo)致心肌細(xì)胞存活率顯著降低(41%±0.6% vs.82%±1.1%,P<0.01),LDH漏出率增加(16.33%±2.3% vs.5.8%±0.7%,P<0.01),Annexin V/PI雙染凋亡細(xì)胞明顯增多(19.9%±1

13、.1% vs.3.1%±0.2%,P<0.01)。GSRd(0.1,1,and10μM)可明顯提高細(xì)胞存活率(59%±1.8%,63%±3.9%,69%±3.7%,P<0.01),降低LDH漏出率(11%±1.7%,10.3%±0.9%,7.3%±0.9%,P<0.05),減少凋亡細(xì)胞(6.3%±0.7%,P<0.01)。結(jié)果表明GSRd可減輕SI/R引起的心肌細(xì)胞壞死,發(fā)揮抗凋亡、保護(hù)心肌細(xì)胞的作用,且該作用在0.1-10μM濃度范圍

14、內(nèi)呈量效關(guān)系。
　　4.與常氧對(duì)照組相比,缺氧3 h復(fù)氧2 h后細(xì)胞內(nèi)ROS生成明顯增加,同時(shí)抗凋亡蛋白分子Bcl-2的表達(dá)降低,促凋亡蛋白分子Bax表達(dá)增加,Bcl-2與Bax比值降低,細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低(P<0.01)。線粒體膜電位去極化促使細(xì)胞色素C等凋亡蛋白,從線粒體釋放至胞質(zhì)是引發(fā)凋亡的關(guān)鍵步驟。GSRd可顯著減少SI/R誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生,促使Bcl-2/Bax比值增加,穩(wěn)定線粒體膜電位,抑制細(xì)胞色素C(Cy

15、t-C)的釋放(0.9±0.03 vs.0.7±0.02,P<0.05),進(jìn)而阻止caspase-9和caspase-3活化過程(P<0.01)。這些結(jié)果提示GSRd可通過凋亡線粒體途徑抑制SI/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。此外,為進(jìn)一步闡明GSRd抗心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制,我們檢測(cè)了SI/R處理后乳鼠心肌細(xì)胞Akt和GSK-3β磷酸化水平。結(jié)果顯示各組間總Akt和GSK-3β表達(dá)無明顯差異。GSRd可有效促進(jìn)SI/R心肌Akt和GSK-3β

16、磷酸化水平。PI3K抑制劑LY294002可顯著降低GSRd激活的SI/R心肌Akt及GSK-3β的磷酸化水平。表明GSRd的心肌保護(hù)機(jī)制與激活A(yù)kt/GSK-3β信號(hào)通路有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.在整體動(dòng)物心臟及體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞上均發(fā)現(xiàn)GSRd減輕MI/R損傷。表現(xiàn)為GSRd改善大鼠MI/R后心臟功能,減小心肌梗死面積和降低心肌細(xì)胞凋亡;增加SI/R乳鼠心肌細(xì)胞存活率,降低細(xì)胞LDH漏出率及減少心肌細(xì)胞caspas

17、e-3和caspase-9活性。
　　2.首次揭示GSRd可減少心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,通過抑制線粒體凋亡通路減輕SI/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。
　　3.GSRd激活A(yù)kt/GSK-3β信號(hào)通路可能參與抗SI/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。
　　上述結(jié)果提示GSRd具有抗氧化應(yīng)激、抗凋亡、保護(hù)缺血/再灌注心臟的作用,其機(jī)制與抑制線粒體凋亡通路及激活A(yù)kt/GSK-3β信號(hào)通路有關(guān)。從而為植物藥GSRd應(yīng)用于臨床防治急性MI/R損