重組質(zhì)粒Her2-Hsp70的構(gòu)建及抗腫瘤作用研究.pdf

1、背景:
　　 乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，發(fā)病率正在逐年上升，常規(guī)治療對晚期患者的痊愈難以奏效，免疫治療以激發(fā)或增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能為手段，選擇性地針對Her2陽性腫瘤細(xì)胞，特異性地發(fā)揮殺傷作用，進(jìn)而達(dá)到控制和殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。許多資料顯示，此法與常規(guī)治療聯(lián)合可顯著提高腫瘤的綜合治療效果。原癌基因Her2是生長因子受體家族成員之一，在25％～30％的侵潤性的乳腺癌中過表達(dá)，Her2的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)，而在正常組織中

2、低表達(dá)，因而成為良好的腫瘤免疫生物治療的靶分子。
　　 大量資料表明熱休克蛋白70可以作為一種強(qiáng)有力的分子佐劑，可作為腫瘤抗原肽的分子載體，在腫瘤抗原呈遞和激活CD8+T細(xì)胞方面發(fā)揮重要作用。HSP70與MHC分子相互作用是抗原識別和呈遞的重要環(huán)節(jié)。由于HSP70分子與MHC分子有極相似的多肽結(jié)合溝，HSP70能夠促進(jìn)MHC分子對腫瘤特異性多肽抗原的識別和呈遞；且HSP70會像MHC-樣能夠作為腫瘤特異性多肽抗原載體與MHC分子

3、共同參與抗原的識別和呈遞。本研究中將分子佐劑HSP70與人Her2基因融合，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Her2-HSP70,觀察其體內(nèi)誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答的能力和抗小鼠乳腺癌免疫治療的作用。通過本實(shí)驗(yàn)希望對乳腺癌的治療找到有效的基因疫苗，為乳腺癌的治療提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　 目的
　　 構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Her2-HSP70,觀察其誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力和抗腫瘤免疫治療的作用。
　　 方法
　　

4、 RT-PCR擴(kuò)增得到人乳腺癌細(xì)胞Her2和Hsp70DNA，構(gòu)建pcDNA3.1/Her2、pcDNA3.1/HSP70、pcDNA3.1/Her2-HSP70重組質(zhì)粒，將pcDNA3.1、pcDNA3.1/Her2分別轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌4T-1細(xì)胞株，獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，應(yīng)用western-blot技術(shù)檢測。將乳腺癌細(xì)胞株4T-1/Her2接種于小鼠皮下，建立腫瘤動物模型，再肌肉注射基因疫苗pcDNA3.1/Her2-HSP70,同時

5、聯(lián)合佐劑BCG、GM-CSF注射，間隔7d，共3次，以pcDNA3.1/Her2、pcDNA3.1/hsp70、pcDNA3.1為對照，觀察小鼠腫瘤的生長；三周后處死小鼠，剝瘤稱重，腫瘤組織HE染色，小鼠脾細(xì)胞用FCM檢測T細(xì)胞表面標(biāo)志即膜分子CD3、CD4、CD8的變化及小鼠血清抗Her2抗體的變化。ELISA法檢測小鼠血清IL-4、IFN-γ水平。
　　 結(jié)果
　　 構(gòu)建了重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切和DNA測序分析,結(jié)果表明該

6、基因的序列與設(shè)計的序列完全相同。獲得了穩(wěn)定表達(dá)4T-1/Her2的細(xì)胞株，根據(jù)氨基酸序列本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的Her2分子量約為69kDa的蛋白；western-blot檢測到轉(zhuǎn)染4T-1/Her2中Her2蛋白的表達(dá)，而4T-1及轉(zhuǎn)染pcDNA3.1的4T-1中沒有檢測到Her2蛋白的表達(dá)。動物實(shí)驗(yàn)表明，用重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Her2-HSP70聯(lián)合佐劑BCG、GM-CSF免疫的BALB/c小鼠，增強(qiáng)了T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，上調(diào)分子IFN-γ

7、的表達(dá)，腫瘤的生長受到抑制。Her2-Hsp70基因疫苗及佐劑應(yīng)用具有較強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)；病理切片結(jié)果顯示融合質(zhì)粒組切片中壞死組織較多，瘤細(xì)胞體積變?。涣魇郊?xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：Her2-hsp70+佐劑免疫小鼠后，CD8細(xì)胞比例較高，CD4/CD8比值較小，說明Hsp70及佐劑在腫瘤抗原呈遞和激活CD8+T細(xì)胞方面發(fā)揮重要作用。
　　 結(jié)論
　　 異種抗原Her2有效地打破了抗腫瘤免疫耐受，HSP70則加強(qiáng)了抗原遞呈作用，