重組嵌合抗菌多肽的構(gòu)建及其在抗感染和抗腫瘤免疫中的作用.pdf

1、細菌及病毒感染是困擾人類很久的問題，尤其是近年來由于抗生素不規(guī)范使用及細菌突變等多方面原因，耐藥菌的感染成為日益嚴重而急需解決的一個難題。內(nèi)源性抗菌肽是一類陽離子短肽，廣泛分布于人體多個部位，具有廣譜抗微生物活性，在不久的將來可能作為新一代抗感染藥物代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素。防御素是人體中一類重要抗菌肽，新近的研究發(fā)現(xiàn)該類分子還是一種多功能免疫活性肽，廣泛地參與了機體的免疫應(yīng)答。本研究應(yīng)用重組嵌合蛋白技術(shù)試圖改造抗菌肽以提高抗菌活性和穩(wěn)定性，構(gòu)建

2、抗菌肽嵌合核酸疫苗以增強抗腫瘤免疫。 本文分三個部分。第一部分是對本實驗室從人子宮頸粘液中分離鑒定出的1個新抗菌肽進行N-端氨基酸序列測定和cDNA克隆，獲得其全長編碼基因，以便用作嵌合肽的構(gòu)建。測序結(jié)果顯示氮端氨基酸序列從第一至第十位依次為脯氨酸(Pro，P)，賴氨酸(Lys，K)，精氨酸(Arg，R)，賴氨酸(Lys，K)，丙氨酸(Ala,A)，天冬氨酸(Asp，D)，甘氨酸(Gly,G)，谷氨酸(Glu，E)，丙氨酸(Al

3、a，A)，賴氨酸(Lys，K)。根據(jù)其氮端氨基酸序列，設(shè)計簡并引物，3'-RACE-PCR技術(shù)擴增出全長cDNA，通過BLAST程序檢索對比分析，確定其為高遷移率蛋白N2(HighmobilitygroupchromosomalproteinN2，HMGN2)，用蛋白質(zhì)二結(jié)構(gòu)軟件分析發(fā)現(xiàn)該分子含1個跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)域，位于該分子氨基酸序列的第17位至42位之間?；瘜W(xué)合成該分子N-端、α-螺旋和C-端肽片段，抗菌活性檢測顯示僅α-螺旋肽片

4、段具有抗菌活性，證明α-螺旋是HMGN2抗菌功能結(jié)構(gòu)域。 第二部分是構(gòu)建HMGN2α-螺旋結(jié)構(gòu)域與富組蛋白-5嵌合抗菌多肽。采用PCR拼接技術(shù)將二者連接起來，構(gòu)建出融合肽原核表達質(zhì)粒pET-32a-His-5-α，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，用IPTG誘導(dǎo)表達，經(jīng)反復(fù)凍融提取菌體蛋白，依次進行親和層析分離，凝血酶酶切去除標(biāo)簽蛋白，高效液相色譜分離純化等多個步驟，得到了重組的融合多肽His5-α?？咕鷻z測顯示融合肽抗大腸桿菌、綠膿桿菌和白色念

5、珠菌的活性強于單一抗菌肽，對溫度和酶的敏感性下降，穩(wěn)定性提高。進一步對其殺菌機制進行探討，發(fā)現(xiàn)融合抗菌肽的主要作用靶目標(biāo)在細菌菌體內(nèi)。激光共聚焦顯微鏡顯示與Histatins僅位于細菌胞漿不同的是，融合蛋白不僅存在胞漿，在胞核也發(fā)現(xiàn)有融合抗菌肽。同時發(fā)現(xiàn)嵌合抗菌肽與細菌DNA結(jié)合能力增強，提示調(diào)節(jié)或者抑制細菌DNA的轉(zhuǎn)錄或翻譯也可能是融合抗菌肽抗菌的重要機制。 第三部分是構(gòu)建前列腺特異性膜抗原PSMA與β-防御素-2的嵌合核酸疫