重組真菌免疫調節(jié)蛋白基因的表達及抗腫瘤作用初步研究.pdf

1、真菌免疫調節(jié)蛋白(fugal immunomodulatory proteins,FIPs)是從高等擔子菌中提取的一類小分子蛋白質。FIPs與真菌凝集素也有相似的凝集活性,能夠促進血細胞凝集;同時還具有與人免疫球蛋白相似的結構和免疫功能,不僅能夠促使淋巴細胞增殖并誘導淋巴細胞產生細胞因子,而且具有一定的抗腫瘤活性。
　　本論文以屬內重組新基因FIP-SN15(通過DNA shuffling技術由赤芝(Ganoderma lucid

2、um)和紫芝(Ganoderma sinense)真菌免疫調節(jié)蛋白基因重組得到)和赤芝(G. lucidum)真菌免疫調節(jié)蛋白基因 FIP-glu為材料,成功構建了原核表達載體 pET30a-FIP-SN15和pET30a-FIP-glu,通過IPTG誘導蛋白在大腸桿菌(Escherichia coli) BL21細胞中高效表達了重組蛋白FIP-SN15和FIP-glu,表達量分別達到了35.95 mg/L和36.67 mg/L。通過B

3、andScan V5.0軟件分析,重組蛋白 FIP-SN15和FIP-glu分別占大腸桿菌總蛋白的51.4％和72.2%,通過Ni-NTA柱純化后2種蛋白質的純度均達到了90%以上。通過Q-tof MS對純化的FIP-SN15蛋白質進行鑒定,得到了4條肽段,其氨基酸殘基與根據(jù)FIP-SN15核苷酸序列預測出的FIP-SN15氨基酸序列匹配率高達91.9%,證明在大腸桿菌中表達并且純化得到的分子量約為18.9kD的蛋白為重組的FIP-SN

4、15蛋白。
　　為了進一步研究重組蛋白FIP-SN15對腫瘤細胞的毒性作用,選用人肺癌細胞 A549(Lung carcinoma)、結腸癌細胞 HT-29(Colon cancer)、肝癌細胞HCC-LM3(Hepatocellular carcinoma)和乳腺癌細胞MDA-MB-231(Breast adenocarcinoma)用MTT法進行了細胞毒性實驗,結果發(fā)現(xiàn),重組蛋白FIP-SN15對肺癌A549細胞和乳腺癌MDA

5、-MB-231細胞的抑制效果較好,其 IC50值分別為24.605和23.921μg/mL;對結腸癌細胞HT-29和肝癌細胞HCC-LM3抑制情況較差,在25μg/mL以下沒有顯著的抑制作用。
　　為了研究FIP-SN15的對癌細胞的凝集活性及抗癌活性,選用人星形膠質瘤細胞系U-251對重組蛋白FIP-SN15進行細胞凝集試驗并使用流式細胞儀(Fluorescence Activated Cell Sorter)分析其誘導細胞凋亡

6、的活性和對細胞周期的影響,同時選用重組蛋白FIP-glu作為對照對上述幾種活性進行了比較實驗。通過reFIPs對 U-251細胞的凝集試驗證實,10μg/mL的重組蛋白reFIPs即可對U-251細胞產生明顯的凝集作用,處理48小時后,細胞凝集成團并脫離貼附表面。通過流式細胞分析發(fā)現(xiàn),FIP-SN15和FIP-glu均能夠顯著抑制細胞從G1期進入S期并能夠明顯誘導U-251細胞的凋亡。這些結果表明, FIP-SN15能有效抑制膠質瘤細胞