泛素-蛋白酶系統(tǒng)在煙堿干預岡田酸誘導的SH-SY5Y細胞死亡模型中的作用研究.pdf

1、泛素蛋白酶系統(tǒng)(ubiquitin-protease syterm,UPS)功能障礙，能夠促進異常蛋白在神經(jīng)元聚集，故目前認為UPS與神經(jīng)退行性病變的發(fā)病關系密切。而臨床研究和大量的體內外實驗中都發(fā)現(xiàn)煙堿對阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)等以大量膽堿能神經(jīng)元丟失為特征的神經(jīng)退行性疾病有保護作用。在AD病中，神經(jīng)元丟失和tan蛋白異常磷酸化導致的神經(jīng)纖維纏結(neurofibrillary tangle，NFT

2、)是其中兩個重要的病理特征。而岡田酸(oka4aaic acid,OA)處理后的人神經(jīng)母細胞瘤細胞株(human neuroblastoma cell，SH-SY5Y)可出現(xiàn)細胞凋亡和tau蛋白異常磷酸化的改變，證明此模型可以部分模擬神經(jīng)退行性疾病的以上特征。 因此，本研究以岡田酸誘導的SH-SY5Y細胞死亡為模型，研究煙堿對岡田酸誘導的SH-SY5Y細胞死亡的干預作用，以及UPS的變化規(guī)律，探討煙堿對細胞的保護作用和可能的機制

3、。 本實驗首先建立岡田酸誘導SH-SY5Y細胞死亡模型，在此模型中觀察到tau蛋白發(fā)生過度磷酸化的改變。接下來利用LDH釋放量和MTT法檢測細胞活性，以觀察煙堿對岡田酸誘導的細胞模型的影響；并輔以DNA-ladder和Hoechst33258核熒光染色觀測細胞凋亡狀況。本實驗還用Western blot測定SH-SY5Y細胞Ser<'396>位點磷酸化tau蛋白水平和泛素蛋白表達水平，以觀察煙堿對泛素蛋白表達和對磷酸化tau蛋白

4、影響的規(guī)律。煙堿(0.1gμmol/L～100μmol/L)孵育SH-SY5Y細胞2小時和10μmol/L煙堿分別孵育細胞不同時間(0.5 h～24 h)后，均可引起細胞內泛素蛋白表達上調，煙堿濃度過大(1000μmol/L)或預處理時間過長(超過24小時)泛素蛋白表達反而上降，證實煙堿能劑量依賴(0.1μmol/L～100μmol/L)和時間依賴(0.5h～24h)的誘導泛素表達上調。該作用能被N受體α7亞型特異性拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素

5、阻斷，因而提示煙堿上調泛素表達可能通過N受體α 7亞型介導。 DNA-ladder和Hoechst33258核熒光染色煙堿(0.1μmol/L～100μmol/L)都顯示25 nmol/L岡陽酸處理細胞24小時后，可見明顯細胞凋亡；LDH和MTT的結果更表明岡田酸能時間(0.5h～24h)和劑量(1.25nmol/L～100nmol/L)相關的誘導的SH-SY5Y細胞死亡。不同濃度煙堿(0.1μmol/L～100μmol/L)預

6、處理細胞不同時間(0.5h～6h)后，上述細胞死亡現(xiàn)象有所改善，煙堿濃度過大(達到1000μmol/L)或預處理時間過長(超過6小時)，細胞死亡反而加重。證實煙堿能劑量依賴(0.1μmol/L～100μmol/L)和時間依賴(0.5h～6h)，減少細胞死亡，該保護作用也能被α-銀環(huán)蛇毒素所阻斷。上述結果表明，煙堿對岡田酸誘導的SH-SY5Y細胞死亡有一定保護作用，呈明顯的劑量-效應和時間.效應關系，且N受體α7亞型介導可能參與了煙堿的保

7、護作用。 Western-blot結果顯示，證實煙堿能劑量依賴(0.1μmol/L～100μmol/L)和時間依賴(0.5h～24h)的在岡田酸誘導的SH-SY5Y細胞模型中誘導泛素表達上調，且該作用能被α-銀環(huán)蛇毒素所阻斷。25nmol/L岡田酸作用SH-SY5Y細胞24小時后可觀察到，tau蛋白ser<'396>位點磷酸化的程度顯著加強，提示岡田酸能導致tau蛋白過度磷酸化，而10μmol/L煙堿能夠降低tau蛋白磷酸化水平

8、，與模型組比較降低了25﹪(P<0.05)，說明煙堿可部分抑制tau蛋白磷酸化。MG132作為UPS抑制劑，能夠加重煙堿預孵模型組中細胞的死亡，與模型組比較細胞死亡率增加了約20﹪(P<0.05)提示煙堿可能通過UPS發(fā)揮其保護作用。 本實驗得出以下結論：1.煙堿可以劑量依賴(0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L)和時間依賴(0.5h、2h、6h、12h)地誘導泛素表達上調。2.煙堿可保護性的

9、干預岡田酸誘導SH-SY5Y細胞tau蛋白過度磷酸化和凋亡，并可在此模型中誘導泛素表達上調。3．煙堿誘導泛素表達上調可能通過N受體α7亞型介導，提示煙堿可能通過增強UPS的活性，發(fā)揮其保護作用。綜上所述，我們認為煙堿可能通過增強UPS活性發(fā)揮其保護作用。由于煙堿的作用廣泛而復雜，增強UPS活性僅為其保護作用的一個方面，深入研究煙堿以及其他UPS調節(jié)劑對維持蛋白酶體的正常功能的作用機制，將有可能為研究和開發(fā)治療AD的藥物方面提供新的線索。