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文檔簡介
1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)又稱老年性癡呆,是一種主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性記憶障礙、認(rèn)知功能障礙、人格改變等的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,目前認(rèn)為是由遺傳和環(huán)境等多種因素引起的。AD的神經(jīng)病理學(xué)特征主要包括神經(jīng)元的大量丟失伴膠質(zhì)細(xì)胞增生、細(xì)胞外異常淀粉樣β(β-amyloid protein,Aβ)蛋白聚集形成的老年斑(senile plaque,SP)沉積和由細(xì)胞內(nèi)超磷酸化tau蛋白組
2、成的神經(jīng)纖維纏結(jié)等。其中,Aβ蛋白的雜亂聚集是阿爾茲海默癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié),而Aβ前體蛋白(APP)基因在DNA水平的變異是造成Aβ增加的主要原因。隨著人口老齡化的進(jìn)程,AD的發(fā)病率逐年上升,AD的防治是近年來研究的熱點(diǎn),而針對其有效的治療藥物依然缺乏。
N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體對于神經(jīng)元突觸的可塑性的維持具有重要的作用,而研究表明Aβ寡聚物的作用依賴于NMDA受體的活
3、化。鹽酸美金剛(Memantine)是金剛烷(adamantine)的一種衍生物,作為NMDA受體的非特異性阻斷劑,已被批準(zhǔn)用于中度到重度AD的治療。多項(xiàng)研究表明memantine可通過非特異性阻斷突觸后NMDA受體的作用來抑制依賴NMDA受體的Aβ肽誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。也有研究顯示在AD的動物和細(xì)胞模型中,美金剛還可通過不依賴于NMDA受體功能的抗細(xì)胞凋亡作用來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。所以美金剛對AD起保護(hù)作用的機(jī)制尚不十分明確。
4、自噬在AD中發(fā)揮的作用一直存在著爭議,有的研究認(rèn)為在AD的神經(jīng)突中自噬的誘導(dǎo)增強(qiáng)和轉(zhuǎn)運(yùn)回神經(jīng)元胞體的過程受阻,會導(dǎo)致自噬小體在受損神經(jīng)突中大量積累。APP、β分泌酶和γ分泌酶在自噬小體中均有明顯表達(dá),反而增加了二者的相互作用時間,所以自噬成為新的Aβ產(chǎn)生途徑,促進(jìn)AD的發(fā)生和進(jìn)展。也有研究顯示通過自噬增強(qiáng)劑增強(qiáng)自噬作用,可減輕AD模型小鼠的認(rèn)知功能障礙,并降低Aβ水平。細(xì)胞自噬上游調(diào)控通路主要有兩種,一種是mTOR依賴的信號通路,即PI
5、3K-Akt-mTOR信號通路;另一種為不依賴mTOR的信號通路,主要是由JNK1活化的Bcl-2/Beclin-1復(fù)合物調(diào)控的信號通路。
鑒于上述自噬在AD中發(fā)揮的作用存在爭議以及memantine對AD治療的作用機(jī)制尚不明確的現(xiàn)狀。本課題建立過表達(dá)人瑞端突變型APP659蛋白的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞作為AD的細(xì)胞模型,明確在該AD模型中自噬對細(xì)胞具有保護(hù)作用還是具有促進(jìn)其凋亡作用,同時探討美金剛對AD細(xì)胞模型細(xì)胞的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞
6、自噬的作用以及通過何種信號通路來調(diào)控自噬作用,以此來揭示美金剛對細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制,旨在為阿爾茨海默病的進(jìn)一步預(yù)防、治療及預(yù)后提供理論依據(jù)。
研究方法:
本實(shí)驗(yàn)分為三部分,首先在體外培養(yǎng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y,瞬時轉(zhuǎn)染建立過表達(dá)瑞典突變型APP695基因的AD細(xì)胞模型并鑒定。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后加入不同終濃度的memantine(1μM、5μM、10μM)處理后,MTT檢測細(xì)胞的存活率。然后,使用memantine和自
7、噬增強(qiáng)劑雷帕霉素共同處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況,吖啶橙染色于激光共聚焦顯微鏡下觀察自噬小體的生成情況,Western blot檢測凋亡蛋白Caspase-3及自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、Atg-5的表達(dá)情況。最后,用memantine處理AD模型細(xì)胞后Western blot檢測自噬信號通路蛋白p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、Bcl-2、Beclin-1及JNK1的表達(dá)情況,免疫熒光
8、單/雙染觀察細(xì)胞中Bcl-2和Beclin-1的定位。
研究結(jié)果:
一、 AD細(xì)胞模型的建立與鑒定
復(fù)蘇神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y,使用APP695重組質(zhì)粒及空質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分為未轉(zhuǎn)染組(Control)、轉(zhuǎn)染試劑組(Mock)、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(NC)以及目的載體轉(zhuǎn)染組(APP695)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后,Real-time PCR檢測各組細(xì)胞APP695的mRNA檢測,48 h后Western
9、 blot檢測各組細(xì)胞APP695蛋白的表達(dá)。
結(jié)果顯示:與Control組相比,APP695組APP695的mRNA及蛋白的水平均顯著提高(P<0.01),而Mock組與NC組APP695蛋白的表達(dá)與Control組相比并無明顯區(qū)別(P>0.05)。
二、 MTT法檢測memantine對AD細(xì)胞模型細(xì)胞生存率的影響
用不同濃度的memantine(1μM、5μM、10μM)處理轉(zhuǎn)染APP695質(zhì)粒以及對
10、照組的細(xì)胞,24 h、48h后MTT實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的存活率。結(jié)果顯示:與對照組相比,APP695質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的存活率明顯下降(P<0.05),而經(jīng)memantine處理后細(xì)胞的存活率明顯升高(P<0.05),且具有劑量依賴性。并確定5μM為memantine最適使用濃度。
三、Memantine對AD模型細(xì)胞自噬作用的影響
用藥物memantine及自噬增強(qiáng)劑雷帕霉素處理轉(zhuǎn)染APP695的細(xì)胞同時設(shè)對照組,實(shí)驗(yàn)分
11、為A:NC組,B:NC+Memantine組,C:APP695組,D:APP695+memantine組,E:APP695+memantine+自噬增強(qiáng)劑組。吖啶橙染色,檢測細(xì)胞各組細(xì)自噬小體水平。Western blot檢測各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、Atg-5的表達(dá)。結(jié)果顯示:與對照組相比,APP695組吖啶橙染色自噬現(xiàn)象明顯,自噬小體增多,且Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/L
12、C3-Ⅰ的比值、Beclin-1、Atg-5均顯著提高(P<0.01);加入memantine后的APP695+memantine組自噬情況及相關(guān)蛋白的表達(dá)水平又恢復(fù)到與對照組無顯著差異的水平(P>0.05);而加入自噬增強(qiáng)劑雷帕霉素的APP695+memantine+自噬增強(qiáng)劑組自噬情況及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平又顯著提高(P<0.01)。
四、Memantine對AD模型抗細(xì)胞凋亡作用與自噬的關(guān)系
用藥物meman
13、tine及自噬增強(qiáng)劑雷帕霉素處理轉(zhuǎn)染APP695的細(xì)胞同時設(shè)對照組,實(shí)驗(yàn)分為A: NC組,B:NC+Memantine組,C:APP695組,D:APP695+memantine組, E:APP695+memantine+自噬增強(qiáng)劑組。AnnexinV-APC/7-AAD染色后經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測。同時Western blot檢測各組細(xì)胞中凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果顯示:與對照組相比,NC+memantine組僅有少量的
14、細(xì)胞凋亡(P>0.05),APP695組的凋亡率顯著提高(P<0.01)。Memantine處理后APP695轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡率下降(P<0.01);經(jīng)memantine及自噬增強(qiáng)劑共同處理后,細(xì)胞的凋亡率明顯升高(P<0.01),接近于APP695無藥物處理組。Western blot結(jié)果顯示APP695組與memantine及自噬增強(qiáng)劑共同處理組Caspase-3的表達(dá)量最高。而與該兩者相比,memantine處理后Caspase-3
15、的表達(dá)明顯降低。
五、 Memantine影響AD模型細(xì)胞自噬的機(jī)制
藥物memantine處理轉(zhuǎn)染APP695質(zhì)粒組細(xì)胞及對照組細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分為A: NC組,B:NC+memantine組,C:APP695組,D: APP695+ memantine組。Western blot檢測各組細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、Bcl-2、Beclin-1、JNK1蛋白的表達(dá)。免疫熒光單染和雙染檢測Bcl-2和Be
16、clin-1的定位,并用共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。結(jié)果顯示:與NC組細(xì)胞相比,APP695組細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01),memantine的加入可以明顯上調(diào)這3種蛋白的表達(dá);同時APP695組細(xì)胞中提高自噬作用的JNK1、Beclin-1蛋白的表達(dá)提高、而抑制自噬的Bcl-2的表達(dá)降低(P<0.01),免疫熒光雙染也顯示Bcl-2與Beclin-1共同定位明顯降低。而上述這三種蛋白的表達(dá)量
17、在memantine處理AD模型細(xì)胞后均發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明memantine通過上調(diào)細(xì)胞中自噬信號通路PI3K-Akt-mTOR和下調(diào)JNK1活化的Bcl-2/Beclin-1復(fù)合物來調(diào)控細(xì)胞的自噬功能。
結(jié)論:
1、Memantine呈濃度依賴性的提高AD模型細(xì)胞的存活率,5μM為memantine對AD模型細(xì)胞的最佳使用濃度。
2、在AD模型細(xì)胞中細(xì)胞的自噬作用是促進(jìn)凋亡的。
3、M
18、emantine能抑制AD模型細(xì)胞的自噬作用。
4、Memantine可抑制AD模型細(xì)胞凋亡,其抗凋亡能力與降低Caspase-3的表達(dá)水平有關(guān)。而且memantine的抗凋亡作用要通過抑制細(xì)胞的自噬作用來實(shí)現(xiàn)。
5、AD模型細(xì)胞中PI3K-Akt-mTOR信號通路被抑制,JNK1促進(jìn)了Bcl-2與Beclin-1分離。
6、Memantine能通過活化PI3K-Akt-mTOR信號通路來抑制AD模型細(xì)胞的
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