菩人丹超微粉對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的保護(hù)作用.pdf

1、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常見(jiàn)和嚴(yán)重的眼部并發(fā)癥,是不可逆性盲的重要因?yàn)椤ｋS著人們生活方式的改變,人均壽命的延長(zhǎng),DR發(fā)病率呈上升趨勢(shì),患者因視網(wǎng)膜微血管病變和神經(jīng)組織病變導(dǎo)致視力損害,嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。因此,DR的防治成為糖尿病及其并發(fā)癥研究領(lǐng)域的重要課題。中藥復(fù)方具有多靶位、多途徑的治療效應(yīng),可充分發(fā)揮中醫(yī)整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢(shì)。菩人丹超微粉(Purendan superfinepowder,

2、PRD)是針對(duì)糖尿病病機(jī)關(guān)鍵“熱、虛、瘀”的中藥復(fù)方,具有益氣養(yǎng)陰清熱、活血化瘀通絡(luò)之功效。本研究采用腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)建立糖尿病大鼠模型,探討PRD對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的保護(hù)作用,為中藥復(fù)方治療DR提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 第一部分菩人丹超微粉對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF和PEDF表達(dá)的影響
　　 目的:
　　 觀察PRD對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vasc

3、ularendothelial growth factor,VEGF)和色素上皮衍生因子(pigmentepithelium-derived factor,PEDF)表達(dá)的影響,探討PRD對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜微血管病變的保護(hù)作用。
　　 方法:
　　 1清潔級(jí)雄性Wistar大鼠36只,隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組、糖尿病模型組和PRD治療組。正常對(duì)照組大鼠不做任何處理；糖尿病模型組、PRD治療組大鼠均建立STZ致糖尿病大鼠模

4、型,以血糖(blood glucose,BG)≥16.7mmol／L作為成模標(biāo)準(zhǔn)。模型成功建立后,糖尿病模型組大鼠不再做任何處理；PRD治療組大鼠給予PRD(1.8g／kg／d)灌胃3個(gè)月。
　　 2采用ONE TOUCH血糖儀檢測(cè)各組大鼠的BG。
　　 3采用蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化。
　　 4分別采用SP免疫組織化學(xué)染色法、Westen blotting法檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜VE

5、GF和PEDF蛋白的表達(dá)。
　　 5采用RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜VEGF和PEDF mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1各組大鼠的BG:糖尿病模型組大鼠的BG為(21.63±1.01)mmol／L,明顯高于正常對(duì)照組大鼠(P<0.01)；PRD治療組大鼠的BG為(14.60±0.95)mmol／L,明顯低于糖尿病模型組大鼠(P<0.01)。
　　 2各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)改變:正常組大鼠視網(wǎng)

6、膜各層結(jié)構(gòu)完整,層次清晰,內(nèi)界膜表面光滑；各級(jí)神經(jīng)細(xì)胞大小均勻,排列有序。模型組可見(jiàn)視網(wǎng)膜內(nèi)界膜明顯腫脹、增厚、表面粗糙不平,部分內(nèi)界膜破裂,偶見(jiàn)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞突出于內(nèi)界膜,視網(wǎng)膜分層欠清晰,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列紊亂、稀疏,細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞空泡樣變、核固縮,部分核溶解。PRD組視網(wǎng)膜內(nèi)界膜輕度腫脹、增厚、表面粗糙欠平,視網(wǎng)膜分層清晰,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列輕度紊亂,數(shù)量輕度減少。
　　 3各組大鼠視網(wǎng)膜VEGF的表達(dá):VEGF蛋白免疫陽(yáng)性

7、產(chǎn)物位于細(xì)胞漿,呈棕黃色顆粒狀。免疫陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層。糖尿病模型組與正常對(duì)照組比較,大鼠視網(wǎng)膜VEGF蛋白及mRNA的表達(dá)均明顯升高(P<0.01)；PRD治療組與模型組比較,大鼠視網(wǎng)膜VEGF蛋白及mRNA的表達(dá)均明顯降低(P<0.01)。
　　 4各組大鼠視網(wǎng)膜PEDF的表達(dá):PEDF蛋白免疫陽(yáng)性產(chǎn)物位于細(xì)胞漿,呈棕黃色顆粒狀。免疫陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層。糖尿病模型組與正常對(duì)

8、照組比較,大鼠視網(wǎng)膜PEDF蛋白及mRNA的表達(dá)均明顯降低(P<0.01)；PRD治療組與模型組比較,大鼠視網(wǎng)膜VEGF蛋白及mRNA的表達(dá)均明顯升高(P<0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 PRD可通過(guò)上調(diào)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜:PEDF表達(dá),下調(diào)VEGF表達(dá),減少視網(wǎng)膜血管滲漏和抑制病理性新生血管形成,發(fā)揮對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜微血管病變的保護(hù)作用。
　　 第二部分菩人丹超微粉對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影

9、響
　　 目的:
　　 通過(guò)觀察PRD對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響,探討PRD對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)組織損傷的保護(hù)作用。
　　 方法:
　　 1清潔級(jí)雄性Wistar大鼠36只,隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組、糖尿病模型組和PRD治療組。正常對(duì)照組大鼠不做任何處理；糖尿病模型組、PRD治療組大鼠均建立STZ(25mg／kg,連續(xù)3d)致糖尿病大鼠模型,以BG≥16.7mmol／L作為成模標(biāo)準(zhǔn)。

10、待模型成功建立后,糖尿病模型組大鼠不再做任何處理；PRD治療組大鼠給予PRD(1.8g／kg／d)灌胃3個(gè)月。
　　 2采用原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
　　 3分別采用SP免疫組織化學(xué)染色法、Western Blotting法檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜B細(xì)胞白血?。馨土鱿嚓P(guān)抗原2(B-cell leukemia／lymphoma2,bcl-2)、B細(xì)胞白血病／淋巴瘤相關(guān)抗原相關(guān)X蛋白(Bc

11、l-associated X,bax)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)蛋白的表達(dá)。
　　 4采用RT-PCR法檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜bcl-2、bax和caspase-3 mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡:各組大鼠視網(wǎng)膜切片均可見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性染色。TUNEL陽(yáng)性產(chǎn)物位于胞核,呈棕黃色顆粒狀,陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層,呈散在分布。模型組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)

12、胞凋亡指數(shù)(Apoptosis Index,AI)較正常組明顯升高(P<0.01)；PRD治療組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞AI較模型組明顯降低(P<0.01)。
　　 2各組大鼠視網(wǎng)膜bcl-2和bax的表達(dá):bcl-2和bax蛋白免疫陽(yáng)性產(chǎn)物均位于細(xì)胞漿,呈棕黃色顆粒狀,bcl-2和bax免疫陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層。糖尿病模型組與正常對(duì)照組比較,大鼠視網(wǎng)膜bcl-2蛋白及mRNA的表達(dá)、bcl-2／bax比值均明

13、顯降低(P<0.01),bax蛋白及mRNA的表達(dá)均明顯升高(P<0.01)；PRD治療組與模型組比較,大鼠視網(wǎng)膜bcl-2蛋白及mRNA的表達(dá)、bcl-2／bax比值均明顯升高(P<0.01),bax蛋白及mRNA的表達(dá)均明顯降低(P<0.01)。
　　 3各組大鼠視網(wǎng)膜caspase-3的表達(dá):caspase-3蛋白免疫陽(yáng)性產(chǎn)物位于細(xì)胞核,呈棕黃色顆粒狀。免疫陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層。糖尿病模型組與正常對(duì)

14、照組比較,大鼠視網(wǎng)膜caspase-3蛋白及mRNA的表達(dá)均明顯升高(P<0.01)；PRD治療組與模型組比較,大鼠視網(wǎng)膜caspase-3蛋白及mRNA的表達(dá)均明顯降低(P<0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1糖尿病大鼠視網(wǎng)膜存在神經(jīng)細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的異常,表現(xiàn)為視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞AI升高,bcl-2表達(dá)降低、bax和caspase-3表達(dá)升高。
　　 2 PRD可通過(guò)上調(diào)bcl-2的表達(dá)、下調(diào)bax和cas