慢病毒介導(dǎo)Akt1基因?qū)Υ笫笮募∪毖俟嘧p傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、目的: 研究慢病毒介導(dǎo)的Akt1（Protein kinase B）基因?qū)Υ笫笤隗w心肌缺血/再灌注（I/R）損傷心肌的保護(hù)作用，觀察其對(duì)大鼠心臟功能、心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡以及Bcl-2、Bax、casepase-9、GSK-3β等Akt1下游基因表達(dá)的影響，初步探討其保護(hù)作用可能的分子機(jī)制；觀察Akt1及其下游底物在經(jīng)典缺血預(yù)處理（IPC）中的表達(dá)，初步探討IPC與轉(zhuǎn)染Akt1基因兩種干預(yù)方式作用的異同點(diǎn)；同時(shí)觀察心肌組織線粒體超

2、微結(jié)構(gòu)及檢測(cè)線粒體通透性轉(zhuǎn)換（MPT）相關(guān)指標(biāo)，初步探討I/R損傷Akt1基因保護(hù)作用和I/R損傷線粒體保護(hù)途徑的關(guān)系。
　　 方法: 將50ul攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）報(bào)告基因和Akt1基因的慢病毒載體（病毒滴度6×107TU），以心肌內(nèi)直接注射的方式轉(zhuǎn)染在體成年大鼠心肌細(xì)胞，7天后后取心肌組織做快速冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況。
　　 48只大鼠隨機(jī)

3、分為6組,每組8只：Ⅰ組為假手術(shù)組（Sham 組）：開(kāi)胸，只穿線不結(jié)扎；Ⅱ組為心肌I/R模型組（I/R組）：心肌內(nèi)微量注射PBS溶液50μl，關(guān)胸后飼養(yǎng)，7d后制備I/R模型；Ⅲ組為轉(zhuǎn)染Akt1基因組（Akt1組）：心肌內(nèi)注射50μl的攜帶Akt1的慢病毒載體，關(guān)胸后飼養(yǎng)，7d后制備I/R模型。Ⅳ組為空載體組（Vechicle Control組）：心肌內(nèi)注射不含Akt1的慢病毒載體50μl，關(guān)胸后飼養(yǎng)，7d后制備I/R模型；Ⅴ組為缺血預(yù)

4、處理組（IPC組），制備長(zhǎng)時(shí)間I/R模型前，給予3次短暫的缺血再灌注；Ⅵ為Akt拮抗組（Ad Block組）：心肌內(nèi)注射攜帶Akt1的慢病毒載體及Akt抑制劑LY294002 ( 5umol/L ) 混合溶液50μl，關(guān)胸后飼養(yǎng)，7d后制備I/R模型。
　　 所有動(dòng)物經(jīng)頸動(dòng)脈插管至左心室記錄HR、LVSP、LVEDP和±dp/dtmax 的變化；檢測(cè)心肌損傷血清學(xué)指標(biāo)cTnI；TTC染色法測(cè)量心肌梗死面積；HE染色光鏡分析組織病

5、理改變；TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡；免疫組化檢測(cè)Bcl-2、Bax、caspase-9、Cyto C表達(dá)；Western Blot方法檢測(cè)Akt、p-Akt、p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)；新鮮心臟組織提取線粒體后，應(yīng)用分光光度法測(cè)定線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開(kāi)放情況；透射電鏡觀察心肌組織線粒體等超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 結(jié)果:
　　 1. 以攜帶GFP的慢病毒為載體將Akt1基因轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，7天后倒置熒光顯微鏡

6、下可見(jiàn)綠色熒光蛋白表達(dá)；
　　 2. Akt1基因轉(zhuǎn)染至在體大鼠心肌，并成功建立大鼠在體I/R模型；
　　 3. 轉(zhuǎn)染Akt1 基因組（Ⅲ組）、IPC組（Ⅴ組）較I/R模型組（Ⅱ組）、空載體組（Ⅳ 組）和Akt1抑制劑組（Ⅵ組）左室心功能（HR、LVSP、LVEDP、±dp/dtmax）改善，心肌損傷生化指標(biāo) cTnI含量下降，心肌梗死面積縮小，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；Ⅱ組、Ⅳ組和Ⅵ組cTnI濃度分別為24.

7、06±8.66ng/ml、20.45±3.99 ng/ml、20.06±7.90 ng/ml,心梗面積分別為34.77±4.06％、33.89±3.33％、32.33±4.92％,上述兩種指標(biāo)三組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；而Ⅲ組與Ⅴ組cTnI濃度分別為12.04±3.35 ng/ml、12.78±3.86 ng/ml; Ⅲ組與Ⅴ組心梗面積分別為17.88±5.25％和21.25±10.44％, 上述兩種指標(biāo)兩組間比較無(wú)統(tǒng)

8、計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。假手術(shù)組（Ⅰ組）在血流動(dòng)力學(xué)、血清cTnI濃度方面均明顯優(yōu)于其余各組（P < 0.05），未見(jiàn)明顯心肌梗死。
　　 4. HE染色的光鏡觀察: 轉(zhuǎn)染Akt1基因組（Ⅲ組）、IPC組（Ⅴ組）較I/R模型組（Ⅱ組）、空載體組（Ⅳ組）和Akt1抑制劑組（Ⅵ組）出血、壞死等損傷性改變輕，形態(tài)大致正常。
　　 5. 假手術(shù)組（Ⅰ組）較其余各組心肌細(xì)胞凋亡明顯減少（P < 0.05），凋亡指數(shù)（AI）為

9、2.13±0.84；轉(zhuǎn)染Akt1基因組（Ⅲ組）、IPC組（Ⅴ組）較I/R模型組（Ⅱ組）、空載體組（Ⅳ組）和Akt1抑制劑組（Ⅵ組）心肌細(xì)胞AI下降（P < 0.05）；Ⅱ組、Ⅳ組、Ⅵ組心肌細(xì)胞AI分別為36.63±4.03、31.75±5.85、34.25±5.00,三者之間相互比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P > 0.05）；而Ⅲ組與Ⅴ組心肌細(xì)胞AI分別為17.88±5.25和21.25±10.44，Ⅲ組較Ⅴ組心肌細(xì)胞AI有降低的趨勢(shì)，但兩組間比

10、較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。
　　 6.假手術(shù)組（Ⅰ組）胞漿內(nèi)Bcl-2、Bax、caspase-9、Cyto C表達(dá)較其余各組減少（P < 0.05）；轉(zhuǎn)染Akt1基因組（Ⅲ組）、IPC組（Ⅴ組）較I/R模型組（Ⅱ組）、空載體組（Ⅳ組）和Akt1抑制劑組（Ⅵ組）Bcl-2表達(dá)上調(diào)而B(niǎo)ax、caspase-9、Cyto C表達(dá)下調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；而I/R模型組（Ⅱ組）與空載體組（Ⅳ組）間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

11、差異（P > 0.05）；轉(zhuǎn)染Akt1 基因組（Ⅲ組）與IPC組（Ⅴ組）間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。
　　 7.假手術(shù)組（Ⅰ組）中總Akt1、p-Akt1（Ser473）、p-GSK3β(Ser9)蛋白表達(dá)較其余各組均減少（P < 0.05）；轉(zhuǎn)染Akt1基因組（Ⅲ組）和Akt制劑組（Ⅵ組）總Akt1蛋白表達(dá)較I/R模型組（Ⅱ組）、空載體組（Ⅳ組）、IPC組（Ⅴ組）增多（P < 0.05），但Ⅲ組與Ⅵ組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

12、義（P > 0.05）；p- Akt1、p-GSK3β(Ser9)蛋白表達(dá)Ⅲ組明顯高于其余各組（P < 0.05），而Ⅴ組則高于Ⅱ組、Ⅳ組、Ⅵ組（P < 0.05），后三組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異增加（P > 0.05）。
　　 8.假手術(shù)組（Ⅰ組）線粒體在540 nm處吸光度值顯著高于其它各組；轉(zhuǎn)染Akt1基因組（Ⅲ組）、IPC組（Ⅴ組）較I/R模型組（Ⅱ組）、空載體組（Ⅳ組）和Akt1抑制劑組（Ⅵ組）吸光度值增高（P < 0.05

13、）；I/R模型組（Ⅱ組）、Akt1抑制劑組（Ⅵ組）和空載體組（Ⅳ組）比較吸光度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P > 0.05）。
　　 9. 假手術(shù)組（Ⅰ組）線粒體呈橢圓形，排列整齊，形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常；其余各組線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)則有不同程度損失變化，其中，Ⅱ組、Ⅳ組、Ⅵ組表現(xiàn)出明顯的線粒體嵴減少，排列紊亂，甚至嵴有斷裂和空泡樣改變現(xiàn)象；而Ⅲ組、Ⅴ組線粒體有輕度腫脹、線粒體嵴排列尚整齊，無(wú)明顯空泡樣改變。
　　 結(jié)論:
　　 1.

14、慢病毒載體可有效地將Akt 1基因轉(zhuǎn)染至在體成年大鼠心?。?br>　　 2. 轉(zhuǎn)染Akt1基因可使心肌梗死面積縮小，減輕心肌損傷，改善心臟功能。
　　 3. Akt1基因具有抗心肌細(xì)胞凋亡作用，促使Bcl-2表達(dá)增多，Bax、caspase-9表達(dá)減少；
　　 4. 轉(zhuǎn)染Akt1基因后，細(xì)胞漿內(nèi)Cyt c、casepase-9表達(dá)相對(duì)減少，心肌I/R損傷線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放程度下降，說(shuō)明再灌注損傷（RI）時(shí)Akt1基