自噬在鎘致大鼠神經(jīng)細(xì)胞毒性中的作用及調(diào)控機(jī)制.pdf

1、自噬在鎘致大鼠神經(jīng)細(xì)胞毒性中的作用及調(diào)控機(jī)制Theroleandregulationmechanismofautophagyinrat’Sneuronsinjuredbycadmium研究生：王棋文導(dǎo)師：劉宗平教授學(xué)科專業(yè)：臨床獸醫(yī)學(xué)資助項目：國家自然科學(xué)基金(31101866。31302058)揚(yáng)州大學(xué)2014年6月?lián)P州大學(xué)博士學(xué)位論文數(shù)陽性細(xì)胞，處理組與對照組差異極顯著(pO01)；吖啶橙染色表明，正常細(xì)胞顯示了較少的紅色熒光，經(jīng)鎘

2、處理后的細(xì)胞內(nèi)紅色熒光強(qiáng)度明顯增加；MDC染色揭示，對照組MDC熒光較弱，20gmol／L鎘處理4h，MDC熒光信號逐漸增強(qiáng)，并有熒光積聚斑點；透射電鏡結(jié)果表明，20gmol／L鎘處理4h，兩種細(xì)胞出現(xiàn)了典型的自噬體，處理24h，染色質(zhì)開始在核周邊積聚，胞質(zhì)空泡化。提示鎘可以誘導(dǎo)兩種細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡。3啟噬在鎘致神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用為了揭示自噬在鎘致神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷中的作用，本研究利用鎘單獨或聯(lián)合自噬的特異性抑制劑羥氯喹(CQ)作用4

3、h，或聯(lián)合誘導(dǎo)劑雷帕霉素(RAP)作用24h，對PC12細(xì)胞和原代神經(jīng)細(xì)胞LC3表達(dá)的影響，MTT法測定了CQ和RAP對兩種細(xì)胞活性的影響。結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用CQ，與4h鎘處理組比較，兩種細(xì)胞LC3II的蛋白表達(dá)量顯著上升(p005)，但細(xì)胞活力都有明顯下降(p005或P001)；聯(lián)合應(yīng)用RAP作用24h，與24h鎘處理組比較，兩種細(xì)胞LC3II的蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)(p005或PO01)，同時細(xì)胞活力顯著上升(p005或P001)。表明

4、自噬在鎘引起的細(xì)胞損傷中起保護(hù)作用。4鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬和凋亡的關(guān)系為了探討鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬與凋亡的相互關(guān)系，本研究利用鎘單獨或聯(lián)合CQ作用4h，或聯(lián)合RAP或caspase抑制劑ZVADfmk作用24h，流式細(xì)胞術(shù)檢測PC12細(xì)胞凋亡率的變化，DAPI熒光染色觀察原代神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞核的變化。結(jié)果表明：與對照組比較，鎘作用24h，PC12細(xì)胞凋亡率從45％增加到458％，差異性極顯著(p001)，鎘聯(lián)合caspase抑制劑ZVADfmk

5、作用24h，細(xì)胞凋亡率明顯降低，與鎘24h比較，差異性極顯著(p001)，進(jìn)一步說明鎘可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生凋亡。與鎘4h組比較，鎘聯(lián)合CQ作用4h，細(xì)胞凋亡率111％增加到337％，差異性極顯著(pO01)；與鎘24h組對比，鎘聯(lián)合RAP作用24h，凋亡率從458％降至147％，差異性極顯著(PO01)。與正常原代神經(jīng)細(xì)胞比較，20gmol／L鎘處理24h組出現(xiàn)染色質(zhì)固縮、核碎裂：鎘聯(lián)合CQ作用4h，損傷的細(xì)胞增多，出現(xiàn)新月狀、濃縮

6、的胞核，甚至出現(xiàn)核碎裂；而鎘聯(lián)合RAP或ZVADfmk組，細(xì)胞的損傷明顯減輕。說明鎘誘導(dǎo)的自噬可以延遲凋亡的發(fā)生。5classIIIP13K／Beclin1／Bcl一2通路在鎘誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬中的作用為研究classIIIP13K／Beclin1／Bcl2通路在自噬中的作用，20gmol／L鎘分別作用PC12和原代神經(jīng)細(xì)胞0、2、4、6、8、12、24h，免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)，加入P13K抑制劑LY2940026h后，觀察相關(guān)蛋