胎兒唇腭裂的三維超聲擴(kuò)展成像與相關(guān)基因突變檢測(cè)及其mRNA表達(dá)研究.pdf

1、唇腭裂畸形是人類最常見的先天發(fā)育性缺陷之一，近年來其發(fā)病率有上升趨勢(shì)。唇腭裂不僅造成患兒容貌畸形，而且影響患兒吸吮、吞咽、語(yǔ)言及面部發(fā)育等功能。因此，早期產(chǎn)前診斷該病具有十分重要的意義。目前超聲檢查是胎兒產(chǎn)前診斷的主要手段，超聲醫(yī)學(xué)的發(fā)展和超聲新技術(shù)的應(yīng)用使胎兒畸形的產(chǎn)前診斷率不斷提高。但是由于胎兒唇腭裂，特別是腭裂受周圍結(jié)構(gòu)聲學(xué)影像影響難于顯示成為產(chǎn)前診斷的難點(diǎn)，亟待出現(xiàn)一種超聲新技術(shù)來提高其產(chǎn)前診斷率，為指導(dǎo)孕婦選擇妊娠結(jié)局提供依據(jù)

2、。傳統(tǒng)的二維超聲對(duì)唇裂診斷已經(jīng)具有了一定的經(jīng)驗(yàn)，但對(duì)腭裂診斷率還非常低，三維超聲表面模式與三平面正交模式的方法從某種程度上提高了腭裂的診斷率，但是還不能滿足臨床需要，而新近開發(fā)的三維超聲多切面技術(shù)檢查胎兒唇腭裂特別是腭裂，提供的信息更加豐富可靠，其研究已受到相關(guān)學(xué)者的矚目，目前國(guó)外相關(guān)報(bào)道還甚少，而國(guó)內(nèi)尚無此方面的報(bào)道。 唇腭裂的發(fā)病機(jī)制目前還不明確，大量的實(shí)驗(yàn)研究以及流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明唇腭裂為以遺傳因素為主的多種因素影響所致

3、。在遺傳學(xué)方面國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)唇腭裂的諸多基因位點(diǎn)進(jìn)行了研究，證實(shí)了部分基因與唇腭裂發(fā)生的關(guān)系，但結(jié)論仍不統(tǒng)一，且由于人種間存在基因多態(tài)性差異，而不同人種間先天性唇腭裂的發(fā)病率也存在差異，所以需要以不同人群為樣本來多角度的從分子水平探索其發(fā)病機(jī)制及致病基因。 本研究首次從胎兒水平深入研究唇腭裂的產(chǎn)前超聲診斷及分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)，包括以下兩大部分：①在二維超聲檢查的基礎(chǔ)上，應(yīng)用三維超聲三平面正交模式及新開發(fā)的三維超聲新技術(shù)多切面即三維擴(kuò)展

4、成像(3DXI)、斷層超聲成像(TUI)來評(píng)價(jià)三維超聲在診斷胎兒唇腭裂中的價(jià)值，尋求準(zhǔn)確而有效的評(píng)價(jià)腭部完整與否的方法。②唇腭裂相關(guān)基因突變檢測(cè)及其mRNA表達(dá)：應(yīng)用PCR-DNA測(cè)序技術(shù)、RT-PCR.技術(shù)檢測(cè)唇腭裂胎兒外周血MSX1、TGFB3、TGFA、IRF6基因突變及其mRNA表達(dá)狀況，探討其與人類唇腭裂畸形發(fā)生的關(guān)系，為尋找人類唇腭裂畸形易感基因提供線索。 材料與方法： 1、選擇經(jīng)我院超聲科檢查的唇腭裂胎兒6

5、8例及能顯示唇部的正常胎兒20例，4例離體胎兒標(biāo)本依次應(yīng)用二維超聲、三維超聲三平面正交模式、三維超聲多切面模式觀察胎兒顏面部，做唇腭裂大小、深度檢測(cè)，并對(duì)各種方法對(duì)正常胎兒唇腭部及唇腭裂的顯示率及成像特點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比分析。 2、應(yīng)用PCR-DNA測(cè)序方法對(duì)46例唇腭裂相關(guān)基因MSX1、TGFB3、TGFA、IRF6進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序，檢測(cè)基因突變，篩選可能的易感基因。 3、應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)MSX1、TGFB3、TG

6、FA、IRF6基因在46例唇腭裂和20例正常對(duì)照組外周血的mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果： 1、產(chǎn)前超聲診斷胎兒唇腭裂的研究：20例正常胎兒上唇二維超聲、三平面正交模式和多切面模式顯示率均為100％；上牙槽突二維超聲顯示率為90％(18/20)，三平面正交模式和多切面模式顯示率均為100％(20/20)；腭部二維超聲顯示率5％(1/20)，三平面正交模式顯示率55％(11/20)，多切面模式顯示率80％(16/20)。在68例

7、異常胎兒中，對(duì)14例單純唇裂二維超聲、三平面正交模式和多切面模式診斷準(zhǔn)確率均為100％(14/14)。對(duì)52例唇裂合并完全性腭裂，其中的唇裂二維超聲、三平面正交模式和多切面模式均顯示52例(100％)；牙槽突裂二維超聲顯示41例(82％)，三平面正交模式和多切面模式均顯示52例(100％)；腭裂二維超聲顯示3例(5.7％)，三平面正交模式顯示31例(59.6％)，多切面模式顯示39例(75％)。2例唇裂合并不完全性腭裂三種方法都僅顯示了

8、唇裂，未顯示腭裂。多切面模式和三平面正交模式檢測(cè)正常腭部顯示率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；多切面模式和二維超聲檢測(cè)正常腭部顯示率差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；三平面正交模式和二維超聲檢測(cè)正常腭部顯示率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。三維超聲多切面模式和三平面正交模式檢測(cè)唇裂合并完全性腭裂中腭裂顯示率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；三維超聲多切面模式和二維超聲檢測(cè)唇裂合并完全性腭裂中腭裂顯示率差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.0

9、5)；三平面正交模式和二維超聲檢測(cè)唇裂合并完全性腭裂中腭裂顯示率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。應(yīng)用多切面模式使胎兒唇腭裂部位在多幅平行切面中連續(xù)顯示，我們可以選擇其中顯示最大裂隙的一幅切面進(jìn)行測(cè)量。單純唇裂患者的裂隙寬度和孕周呈正相關(guān)(r=0.836,P<0.0005)。唇裂合并完全性腭裂患者的唇裂部位、牙槽突裂部位和腭裂部位的裂隙寬度和孕周均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.587、0.514和0.648。將4例離體胎兒標(biāo)本置于水槽中進(jìn)

10、行超聲檢查，結(jié)果顯示胎兒鼻孔、上唇裂隙和牙槽突中斷處顯示清晰，硬腭裂隙處呈無回聲暗區(qū)，與鼻腔相通。 2、胎兒唇腭裂相關(guān)基因突變檢測(cè)：采用PCR-DNA測(cè)序法擴(kuò)增46例唇腭裂引產(chǎn)胎兒及新生兒候選基因片段并測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1號(hào)樣本MSX1基因在1253位點(diǎn)多一個(gè)c，造成移碼突變，而TGFB3基因測(cè)序無陽(yáng)性結(jié)果。篩選結(jié)果提示：MSX1、TGFB3可能為唇腭裂的易感基因。 3、胎兒唇腭裂相關(guān)基因表達(dá)的研究：RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：M

11、SX1基因mRNA在唇腭裂患者表達(dá)水平(1.39±0.36)明顯低于正常對(duì)照組標(biāo)本的表達(dá)(1.69±0.21)，(P=0.02)；TGFB3基因mRNA在唇腭裂患者表達(dá)水平(0.72±0.28)明顯低于正常對(duì)照組(0.94±0.34)，(P=0.045);TGFA基因mRNA在唇腭裂患者表達(dá)水平(0.45±0.16)低于正常對(duì)照組(0.65±0.58)，但無顯著性意義(P=0.295)；IRF6基因mRNA在唇腭裂患者表達(dá)水平(1.39

12、±1.23)低于正常對(duì)照組(1.88±1.29)，但無顯著性意義(P=0.275)。 結(jié)論： 1、三維超聲多切面模式和三平面正交模式可以明顯提高產(chǎn)前診斷胎兒唇腭裂的準(zhǔn)確度，尤其在診斷腭裂上比二維超聲檢查具有更大優(yōu)勢(shì)。 2、研究應(yīng)用多切面模式成功獲得了胎兒正常腭部及腭裂的特征性圖像，多切面模式在評(píng)價(jià)胎兒牙槽突和腭部的完整性上具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。 3、唇裂、牙槽突裂和腭裂部位的裂隙寬度和孕周呈正相關(guān)。