脂肪來源的干細胞（ADSCs）的可塑性及在修復牙槽骨缺損中的實驗研究.pdf

1、隨著組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，種子細胞的來源問題已經(jīng)成為制約其發(fā)展的一個重要的因素。自ADSCs發(fā)現(xiàn)以來，人們對其的研究不斷深入。近幾年，越來越多的實驗證實，ADSCs可以向成骨細胞、成軟骨細胞、神經(jīng)細胞、肌細胞和脂肪細胞等不同胚層來源的細胞分化。而且脂肪組織來源廣泛、取材容易、便于自體移植；ADSCs在體外長期培養(yǎng)的過程中始終保持其多向分化潛能、遺傳背景相當穩(wěn)定、體內(nèi)植入后少有免疫排斥的問題，因而是一種非常理想的組織工程種子細胞。本課題

2、對其生物學特性、可塑性以及復合PLGA后對修復牙槽骨的缺損進行了研究，以期為ADSCs進一步的應用提供實驗依據(jù)。 第一部分目的：研究ADSCs的生物學特性及遺傳學特性。方法：從人脂肪組織中分離出干細胞；利用倒置顯微鏡觀察其形態(tài)；利用細胞計數(shù)試劑盒(cellcountingkit-8)測定其生長特性；利用流式細胞儀檢測其表面標志及細胞周期；利用染色體核型分析技術(shù)檢測第20代細胞的遺傳學特性。結(jié)果：ADSCs在體外呈長梭形；群體倍增

3、時間約為29h；在其表面分子中CD29、CD90、CD44呈陽性；對數(shù)生長期的細胞80％以上處于G0和G1期；第20代細胞仍具有正常的二倍體核型。結(jié)論：ADSCs分離培養(yǎng)容易、增殖速度穩(wěn)定、增殖能力較強、遺傳學穩(wěn)定性良好。 第二部分目的：檢測ADSCs的可塑性。方法：①利用地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉等將其向成骨細胞誘導分化，并對誘導21d后的細胞進行AKP和VonKossa染色；②用3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(isobu

4、ty1-methylxanthine，IBMX)、地塞米松、胰島素、吲哚美辛等將其向脂肪細胞誘導分化，并對誘導21d后的細胞進行油紅O染色；③利用3bFGF、ATRA(全反維甲酸)、BME、BHA及DMSO等將其向神經(jīng)細胞誘導分化，并對誘導14d后的細胞進行NSE和GFAP免疫組織化學染色；④利用HGF和FGF-4等將其向肝細胞誘導分化，對誘導7d和14d后的細胞進行AFP、CK-18和ALB的免疫熒光染色，利用RT-PCR的方法檢測誘

5、導7d和14d后的細胞目的基因的表達量；⑤利用bFGF和EGF等將其向內(nèi)皮細胞誘導分化，并對誘導14d后的細胞進行VWF、FLT-1、FLK-1和CD34免疫熒光染色。結(jié)果：向成骨細胞誘導后，AKP和VonKossa染色均為陽性；向脂肪細胞誘導后，油紅O染色陽性；向神經(jīng)細胞誘導分化后，NSE和GFAP免疫組織化學染色均為陽性；向肝細胞誘導分化后，分化后的細胞AFP、CK-18和ALB的免疫熒光染色均為陽性，RT-PCR結(jié)果顯示：分化后的

6、細胞均表達AFP、CK-18和ALB；向內(nèi)皮細胞誘導分化后，VWF、FLT-1、FLK-1和CD34免疫熒光染色均為陽性。結(jié)論：ADSCs可以向成骨細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞、內(nèi)皮細胞和肝細胞等三個不同胚層來源的細胞分化，具有良好的可塑性。 第三部分目的：以兔ADSCs為種子細胞，PLGA為支架材料，通過組織工程的原理和方法修復牙槽骨缺損。方法：取兔腹股溝處脂肪墊，用差異貼壁的方法分離培養(yǎng)ADSCs；條件培養(yǎng)基體外誘導后進行免疫組

7、織化學染色；將細胞和支架材料復合，掃描電鏡觀察細胞和支架材料的生物相容性；制備動物模型，將實驗分為四組：預誘導實驗組移植附著細胞的且經(jīng)過體外預誘導3d的PLGA；非預誘導實驗組移植附著細胞的且不經(jīng)過體外預誘導的PLGA；材料對照組移植單純的支架材料；空白對照組不做任何處理。12周后處死動物，組織學方法檢測新骨形成情況，比較各組之間的差異。結(jié)果：體外經(jīng)過誘導的ADSCs表現(xiàn)出了成骨細胞的活性；掃描電鏡結(jié)果顯示：細胞在支架材料表面生長良好，

8、呈長梭形。12周后，預誘導實驗組骨再生高度為3.7mm±0.6mm，修復率為74％；非預誘導實驗組骨再生高度為2.8mm±0.6mm，修復率為56％；材料對照組骨4再生高度為1.1mm±0.4mm，修復率為22％；空白對照組骨再生高度為0.9mm±0.5mm，修復率為14％。兩實驗組之間以及實驗組與對照組之間的牙槽骨再生高度以及修復率均有顯著性差異。結(jié)論：利用PLGA復合自體ADSCs有良好的新骨形成能力，在牙槽骨和頜骨缺損中有著良好的