成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞可塑性的體外研究.pdf

1、第一部分骨髓間充質(zhì)干細胞的多向分化潛能 第一章體fl,誘導(dǎo)成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化為5羥色胺敏感性神經(jīng)元 目的：體外誘導(dǎo)成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化為具有神經(jīng)元表型和部分功能的細胞。 方法：將取自6-8周成年SD大鼠股、脛骨的細胞貼壁傳代培養(yǎng)至6-10代，采用有限稀釋法對細胞作單克隆純化。在全反式視黃酸預(yù)誘導(dǎo)24小時后，HBSS洗去含血清培養(yǎng)液，換用改良的Woodbury長時程神經(jīng)元誘導(dǎo)液培養(yǎng)細胞，3、6、9

2、、12、24、48、72、96小時后顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化；細胞免疫染色檢測神經(jīng)元標志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶、神經(jīng)絲M+H、5-羥色胺的表達；并用胞內(nèi)鈣代謝測定法測定誘導(dǎo)前后細胞對5-HT的功能反應(yīng)。 結(jié)果：改良神經(jīng)元誘導(dǎo)液處理3小時后，細胞開始表現(xiàn)神經(jīng)元的形態(tài)特征，細胞折光性增強，形成收縮的雙極或多極胞體和細長突起。細胞可以維持神經(jīng)元樣存活72小時以上。誘導(dǎo)5小時后，對免疫染色的細胞用DAPI進行復(fù)染，92．4±6．9％的細

3、胞表達神經(jīng)元特異性烯醇化酶。誘導(dǎo)24小時后，93．9±5．2％的細胞表達成熟神經(jīng)元的標志物神經(jīng)微絲H。在給予5一羥色胺刺激時可以產(chǎn)生與神經(jīng)元相似的胞內(nèi)鈣離子峰，且免疫組化證實5-羥色胺1A受體在干細胞上表達微弱，但在分化后的神經(jīng)元中表達較強。 結(jié)論：本實驗從形態(tài)、細胞標志物、功能幾方面顯示rMSCs可分化為5一羥色胺敏感性神經(jīng)元。 第二章體外誘導(dǎo)成年大鼠骨髓干細胞分化為上皮樣細胞 目的：將已成功誘導(dǎo)為5

4、-HT敏感性神經(jīng)元的單克隆rMSCs置于極性上皮細胞生長的滲透性濾膜上觀察其向上皮細胞方向分化情況。 方法：取同一單克隆來源的rMSCs按照2×lO5個細胞／0．45cm2的密度種在漂浮在培養(yǎng)液上的滲透性濾膜上(常用于極性上皮細胞的培養(yǎng))，置于37℃、5％C02的濕化孵箱中培養(yǎng)4天。將半透膜上細胞直接鏡下觀察或蘇木素染色冰凍切片觀察細胞形態(tài)變化；免疫熒光染色、RT-PCR、WesternBlotting檢測細胞標志物在不同水平的

5、表達情況；短路電流檢測細胞的電生理特性。 結(jié)果：蘇木素染色顯示rMSCs在生長于滲透性濾膜上4天后形成了緊密的單層。免疫熒光染色顯示此生長在滲透性濾膜上的單層細胞表達上皮細胞標志物細胞角蛋白5&8。RT-PCR結(jié)果也顯示生長在滲透性濾膜而不是生長在培養(yǎng)瓶中的rMSCs表達上皮鈉通道(ENaC)、囊性纖維跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)子(CFTR)和緊密聯(lián)結(jié)蛋白ZO—l的mRNA。但是，用WesternBlotting僅檢測到ZO一1的表達。短路電

6、流測定法顯示生長在滲透性濾膜上的rMSCs來源細胞單層的電阻為30-50Ω，但對CFTR和ENaC的激動劑或阻斷劑無反應(yīng)。 結(jié)論：極性上皮細胞生長的培養(yǎng)條件能誘導(dǎo)rMSCs向上皮樣細胞分化。這些上皮樣細胞表現(xiàn)上皮細胞形態(tài)，表達部分上皮細胞標志物，但不具有成熟上皮細胞離子通道的功能。 第二部分rMSCs來源的神經(jīng)元和上皮樣細胞可以通過去分化和再分化途徑相互轉(zhuǎn)變 目的：首先從功能上證實rMSCs來源的神經(jīng)元可

7、以被誘導(dǎo)去分化、增殖和再分化，然后研究干細胞來源的神經(jīng)元和上皮前體細胞能否在所建立的體外培養(yǎng)誘導(dǎo)條件下通過去分化再分化實現(xiàn)相互轉(zhuǎn)變。 方法：在誘導(dǎo)rMSCs分化為神經(jīng)元24小時后，換用含血清培養(yǎng)液，再過24小時后，按照2×lO5個細胞／0．45cm2的密度轉(zhuǎn)移至滲透性濾膜上培養(yǎng)4天。然后將細胞刮下，轉(zhuǎn)移至有含血清培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，24小時后換為神經(jīng)元預(yù)誘導(dǎo)液，一天后傾去預(yù)誘導(dǎo)液并用HBSS清洗細胞后加入改良神經(jīng)元誘導(dǎo)液。繼續(xù)培養(yǎng)

8、24小時。鏡下觀察細胞形態(tài)改變，胞內(nèi)鈣代謝法檢測細胞的功能改變。 結(jié)果：在rMSCs分化為神經(jīng)元24小時后，換用含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時，所有的神經(jīng)元表型的細胞均恢復(fù)rMSCs形態(tài)。去分化的細胞增殖24小時后按照誘導(dǎo)上皮細胞分化的濃度轉(zhuǎn)移至滲透性濾膜上，4天后細胞形成緊密單層并可測得與直接由rMSCs形成的細胞單層相似的跨上皮電壓、電阻和電流。將上皮樣細胞從滲透性濾膜上刮下種在培養(yǎng)皿中的蓋玻片上，單個散在的上皮樣細胞可以被誘導(dǎo)去