脂肪干細(xì)胞復(fù)合牛心包膜修復(fù)兔腹壁缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、【背景和目的】
　　近年來，組織工程技術(shù)在女性盆底重建外科學(xué)的研究中得到了越來越多的應(yīng)用，是女性盆底重建外科學(xué)的一個(gè)重要的發(fā)展領(lǐng)域。本論文針對目前盆底重建手術(shù)面臨的一些侵蝕（erosion）、性交痛(dyspareunia)、暴露(exposure)、收縮(shrinkage)、瘺管（fistula）等術(shù)后并發(fā)癥問題，構(gòu)建一種脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）復(fù)合脫細(xì)胞牛心包膜（acel

2、lular bovine pericardium，ABP）的新型網(wǎng)片，并將其用于修復(fù)兔腹壁缺損模型，探索組織工程技術(shù)在女性盆底重建中的應(yīng)用，為女性盆底重建的研究提供新思路。
　　【方法】
　　1、兔ADSCs的分離培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記：
　?。?）使用酶消化法、差速貼壁法取兔腹股溝區(qū)脂肪組織體外分離培養(yǎng)兔脂肪干細(xì)胞，每日在顯微鏡下觀察記錄其增殖特征及形態(tài)特點(diǎn)；
　?。?）流式細(xì)胞儀鑒定第3代脂肪干細(xì)胞的表面標(biāo)記物并分

3、別行成脂、成骨誘導(dǎo)分化，證明其多向分化能力；
　?。?）取第3代脂肪干細(xì)胞，以慢病毒介導(dǎo)的綠色熒光蛋白（pGC FU-EGFP-Lentivirus）轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)倒置熒光顯微鏡觀察EGFP的表達(dá)情況；
　　（4）取經(jīng)pGC FU-EGFP-Lentivirus標(biāo)記的第5代脂肪干細(xì)胞，利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測pGC FU-EGFP-Lentivirus的轉(zhuǎn)染率。
　　2、交聯(lián)ABP的制備：交聯(lián)ABP由上海欣吉特生物科

4、技有限公司提供。行HE染色觀察其脫細(xì)胞效果及組織結(jié)構(gòu)。
　　3、組織工程生物活性補(bǔ)片的構(gòu)建：
　?。?）將經(jīng)pGC FU-EGFP-Lentivirus標(biāo)記的第5代兔ADSCs接種于脫細(xì)胞牛心包膜上，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的生長情況；
　?。?） MTT法檢測脂肪干細(xì)胞在脫細(xì)胞牛心包膜上的增殖情況。
　　4、兔腹壁缺損模型的建立及補(bǔ)片性能的評估：
　　（1）于12只成年雌性新西蘭大白兔腹壁制作腹壁缺損模型，根據(jù)

5、不同的處理方式分為以下4組：實(shí)驗(yàn)組（將復(fù)合兔ADSCs的交聯(lián)ABP植入兔腹壁缺損處）；交聯(lián)ABP植入+干細(xì)胞注射組（將交聯(lián)ABP植入兔腹壁缺損處后ABP下注射干細(xì)胞）；交聯(lián)ABP植入組（單純交聯(lián)ABP植入）；空白對照組（腹壁缺損處不作任何處理）；
　?。?）分別于移植后第1、2、3月取出移植物行組織學(xué)觀察評價(jià)宿主的炎癥反應(yīng)及兔ADSCs復(fù)合交聯(lián)ABP的生物相容性；行熒光顯微鏡觀察兔腹壁缺損處綠色熒光蛋白的表達(dá)情況；行拉力試驗(yàn)研究生

6、物活性補(bǔ)片植入后的生物力學(xué)性能。
　　【結(jié)果】
　　1、傳代培養(yǎng)的兔ADSCs形態(tài)較為均勻，呈旋渦狀、輻射狀排列，體外增殖穩(wěn)定快速。流式細(xì)胞儀檢測示CD29、CD90、CD105表達(dá)陽性，CD34表達(dá)陰性，油紅O及茜素紅染色均為陽性。
　　2、HE染色顯示牛心包膜的細(xì)胞基本脫去，呈由染成紅色的膠原纖維組成網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)。
　　3、pGC FU-EGFP-Lentiviru轉(zhuǎn)染兔ADSCs48小時(shí)后，熒光顯微鏡可觀察到

7、EGFP高表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測示pGC FU-EGFP-Lentivirus的轉(zhuǎn)染率達(dá)78%左右。此外，熒光顯微鏡觀察示ADSCs在ABP上黏附生長良好，MTT示細(xì)胞增殖能力與未接種于脫細(xì)胞牛心包膜的ADSCs無明顯區(qū)別。
　　4、所有動(dòng)物均未發(fā)生補(bǔ)片侵蝕。實(shí)驗(yàn)組和交聯(lián)ABP+干細(xì)胞注射組移植后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的移植物皺縮及粘連均顯著小于單純交聯(lián)ABP植入組。熒光顯微鏡觀察示植入后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和交聯(lián)ABP+干細(xì)胞注射組均可觀察到E

8、GFP表達(dá)，EGFP的表達(dá)量未見明顯差別，且隨著時(shí)間的推移EGFP的表達(dá)量均未見明顯減弱。組織學(xué)觀察示實(shí)驗(yàn)組和交聯(lián)ABP+干細(xì)胞注射組的生物相容性均優(yōu)于單純交聯(lián)ABP植入組，而實(shí)驗(yàn)組與交聯(lián)ABP+干細(xì)胞注射組之間無明顯差別。
　　5、拉力試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)植入后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)含有交聯(lián)ABP的各個(gè)組的斷裂拉伸應(yīng)力參數(shù)均高于空白組，而實(shí)驗(yàn)組及交聯(lián)ABP+干細(xì)胞注射組的斷裂拉伸應(yīng)力參數(shù)則高于單純交聯(lián)ABP植入組。隨植入時(shí)間的延長，各個(gè)組的斷裂拉伸應(yīng)力