人類白細(xì)胞抗原G對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖功能的研究.pdf

1、研究背景：人類白細(xì)胞抗原G(human leukocyte antigen,HLA-G)基因位于6號(hào)染色體短臂上的一群緊密連鎖基因群，它所編碼的主要組織兼容性復(fù)合物屬非經(jīng)典HLA-I類分子。HLA-G分子具有選擇性的組織分布；有限的分子多態(tài)性；mRNA選擇性剪接形成不同的異構(gòu)體分子，分別編碼不同的蛋白質(zhì)分子亞型的特點(diǎn)。早期研究認(rèn)為HLA-G限制性表達(dá)于正常妊娠時(shí)母胎界面的絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)HLA-G蛋白還表達(dá)于胎兒絨毛膜絨毛的

2、血管內(nèi)皮細(xì)胞、羊水、絨毛基底層的增殖性細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞及胸腺上皮組織等部位。妊娠被認(rèn)為是成功的同種異體移植，HLA-G在母胎界面的表達(dá)對(duì)母胎免疫耐受和維持正常妊娠有重要作用，很多妊娠相關(guān)疾病與滋養(yǎng)細(xì)胞異常增殖、浸潤(rùn)，胎盤形成不良有關(guān)。某些由于滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和浸潤(rùn)異常有關(guān)的妊娠相關(guān)疾病與HLA-G的異常表達(dá)有關(guān)。HLA-G通過抑制妊娠期子宮蛻膜內(nèi)自然殺傷細(xì)胞（dNK）和細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）等的細(xì)胞毒作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子釋放的平衡，提高胚胎的

3、卵裂速率等機(jī)制在母胎免疫耐受和胚胎分裂、著床等方面發(fā)揮著重要作用。因此HLA-G可能具有調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、分化的功能，同時(shí)保護(hù)這些細(xì)胞免受母體免疫細(xì)胞的攻擊。HLA-G的研究是一個(gè)相對(duì)較新的領(lǐng)域,我們的研究具有重要的理論及臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究有可能發(fā)現(xiàn)HLA-G的新功能，對(duì)深入了解妊娠免疫耐受機(jī)制及妊娠相關(guān)疾病及病理妊娠的發(fā)病機(jī)制具有重要的意義。對(duì)輔助生殖技術(shù)的發(fā)展具有潛在的臨床價(jià)值。
　　外源和內(nèi)源性雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)同源序

4、列基因表達(dá)受抑制的現(xiàn)象稱為RNA干擾(RNA interfering，RNAi)。RNAi現(xiàn)象在一系列的生物中存在，包括植物、真菌、錐蟲、囊蟲、果蠅和線蟲。在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也能觀察到這一現(xiàn)象。小分子干擾RNA(small interfering RNAs，siRNAs)是介導(dǎo)RNAi反應(yīng)的效應(yīng)物。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。

5、　　研究目的：構(gòu)建特異性針對(duì)靶基因HLA-G基因的siRNA腺病毒載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人絨癌細(xì)胞株JEG-3,下調(diào)該細(xì)胞HLA-G基因表達(dá)水平。在體外建立HLA-G低表達(dá)的細(xì)胞模型。通過實(shí)驗(yàn)的方法檢測(cè)腺病毒載體對(duì)JEG-3細(xì)胞的感染效率。然后用這個(gè)HLA-G低表達(dá)的滋養(yǎng)細(xì)胞模型進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討HLA-G對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖功能的調(diào)節(jié)。
　　研究方法：應(yīng)用RNAi技術(shù)，使用高表達(dá)HLA-G的JEG-3細(xì)胞系（來源于人絨毛膜癌細(xì)胞）進(jìn)行滋

6、養(yǎng)細(xì)胞功能研究。構(gòu)建可以轉(zhuǎn)錄出特異干涉HLA-GmRNA的siRNA的重組腺病毒載體來下調(diào)JEG-3細(xì)胞系HLA-G表達(dá)水平。通過腺病毒載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染JEG-3細(xì)胞建立HLA-G低表達(dá)的滋養(yǎng)細(xì)胞模型。
　　1)通過X-Gal染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組腺病毒載體對(duì)JEG-3細(xì)胞感染效率;
　　2)對(duì)HLA-G降調(diào)節(jié)后的滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行非放射性細(xì)胞毒測(cè)定,檢測(cè)490nm處的OD值，OD值即可代表細(xì)胞增殖的相對(duì)數(shù)量。
　　結(jié)果：
　　

7、①構(gòu)建了重組腺病毒載體，可以高效轉(zhuǎn)染HLA-G高表達(dá)的JEG-3細(xì)胞株，在MOI100時(shí)感染效率可達(dá)100％，并且產(chǎn)生明顯HLA-GRNAi效果，建立HLA-G低表達(dá)的細(xì)胞模型；
　　②對(duì)HLA-G降調(diào)節(jié)后的滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行非放射性細(xì)胞毒測(cè)定,檢測(cè)490nm處的OD值。得到轉(zhuǎn)染后目的siRNA組、非特異siRNA組和空白對(duì)照組的OD490nm值分別是2.368±0.187、2.681±0.163和2.725±0.237，對(duì)三個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)