人類白細胞抗原G對滋養(yǎng)細胞增殖功能的研究.pdf

1、研究背景：人類白細胞抗原G(human leukocyte antigen,HLA-G)基因位于6號染色體短臂上的一群緊密連鎖基因群，它所編碼的主要組織兼容性復合物屬非經典HLA-I類分子。HLA-G分子具有選擇性的組織分布；有限的分子多態(tài)性；mRNA選擇性剪接形成不同的異構體分子，分別編碼不同的蛋白質分子亞型的特點。早期研究認為HLA-G限制性表達于正常妊娠時母胎界面的絨毛外細胞滋養(yǎng)細胞。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)HLA-G蛋白還表達于胎兒絨毛膜絨毛的

2、血管內皮細胞、羊水、絨毛基底層的增殖性細胞滋養(yǎng)層細胞及胸腺上皮組織等部位。妊娠被認為是成功的同種異體移植，HLA-G在母胎界面的表達對母胎免疫耐受和維持正常妊娠有重要作用，很多妊娠相關疾病與滋養(yǎng)細胞異常增殖、浸潤，胎盤形成不良有關。某些由于滋養(yǎng)細胞增殖和浸潤異常有關的妊娠相關疾病與HLA-G的異常表達有關。HLA-G通過抑制妊娠期子宮蛻膜內自然殺傷細胞（dNK）和細胞毒性T細胞（CTL）等的細胞毒作用，調節(jié)細胞因子釋放的平衡，提高胚胎的

3、卵裂速率等機制在母胎免疫耐受和胚胎分裂、著床等方面發(fā)揮著重要作用。因此HLA-G可能具有調節(jié)滋養(yǎng)細胞增殖、分化的功能，同時保護這些細胞免受母體免疫細胞的攻擊。HLA-G的研究是一個相對較新的領域,我們的研究具有重要的理論及臨床應用價值。本研究有可能發(fā)現(xiàn)HLA-G的新功能，對深入了解妊娠免疫耐受機制及妊娠相關疾病及病理妊娠的發(fā)病機制具有重要的意義。對輔助生殖技術的發(fā)展具有潛在的臨床價值。
　　外源和內源性雙鏈RNA在細胞內誘導同源序

4、列基因表達受抑制的現(xiàn)象稱為RNA干擾(RNA interfering，RNAi)。RNAi現(xiàn)象在一系列的生物中存在，包括植物、真菌、錐蟲、囊蟲、果蠅和線蟲。在培養(yǎng)的哺乳動物細胞中也能觀察到這一現(xiàn)象。小分子干擾RNA(small interfering RNAs，siRNAs)是介導RNAi反應的效應物。由于使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域。

5、　　研究目的：構建特異性針對靶基因HLA-G基因的siRNA腺病毒載體，瞬時轉染人絨癌細胞株JEG-3,下調該細胞HLA-G基因表達水平。在體外建立HLA-G低表達的細胞模型。通過實驗的方法檢測腺病毒載體對JEG-3細胞的感染效率。然后用這個HLA-G低表達的滋養(yǎng)細胞模型進行功能實驗，進一步探討HLA-G對滋養(yǎng)細胞增殖功能的調節(jié)。
　　研究方法：應用RNAi技術，使用高表達HLA-G的JEG-3細胞系（來源于人絨毛膜癌細胞）進行滋

6、養(yǎng)細胞功能研究。構建可以轉錄出特異干涉HLA-GmRNA的siRNA的重組腺病毒載體來下調JEG-3細胞系HLA-G表達水平。通過腺病毒載體瞬時轉染JEG-3細胞建立HLA-G低表達的滋養(yǎng)細胞模型。
　　1)通過X-Gal染色實驗檢測重組腺病毒載體對JEG-3細胞感染效率;
　　2)對HLA-G降調節(jié)后的滋養(yǎng)細胞進行非放射性細胞毒測定,檢測490nm處的OD值，OD值即可代表細胞增殖的相對數量。
　　結果：
　　

7、①構建了重組腺病毒載體，可以高效轉染HLA-G高表達的JEG-3細胞株，在MOI100時感染效率可達100％，并且產生明顯HLA-GRNAi效果，建立HLA-G低表達的細胞模型；
　?、趯LA-G降調節(jié)后的滋養(yǎng)細胞進行非放射性細胞毒測定,檢測490nm處的OD值。得到轉染后目的siRNA組、非特異siRNA組和空白對照組的OD490nm值分別是2.368±0.187、2.681±0.163和2.725±0.237，對三個實驗組進