人類白細胞抗原G(HAL-G)在胃癌發(fā)生發(fā)展及預后中的作用研究.pdf

1、目的:
　　 檢測人類白細胞抗原-G(HLA-G)在胃癌組織及細胞系中的表達,初步探討其在胃癌免疫逃逸中的作用機理及臨床意義,并評估其在胃癌診斷和預后中的價值。
　　 方法:
　　 1.應用免疫組織化學SP法檢測HLA-G及Tregs在179例胃癌組織及相應癌旁正常胃組織中的分布及表達情況,探討其與胃癌臨床病理特點及復發(fā)預后的關系。
　　 2.應用Western Blot法檢測HLA-G在30例胃癌組織及

2、相應癌旁正常胃組織中的表達,證實HLA-G的表達在癌組織與正常組織間存在差異。
　　 3.應用RT-PCR、Real-time PCR和Flow Cytometry檢測胃癌細胞系AGS、BGC-823、SGC-7901、MKN-45、MKN-28和HGC-27中HLA-G的表達。
　　 4.應用脂質體2000將pVITR02-mcs vector-HLA-G及對照空載體pVITRO2-mcsvector分別轉染到細胞系S

3、GC-7901內,利用潮霉素B進行穩(wěn)篩后分別稱為SGC-7901-G和SGC-7901-V細胞系。然后利用Real-time PCR和western blot檢測轉染前后HLA-G的表達。并與健康人PBMC進行共培養(yǎng),檢測培養(yǎng)體系中CD3+CD25+FoxP3+T細胞的變化,同時應用酶標記免疫吸附測定法(ELISA)檢測共培養(yǎng)體系中IL-2,IL-4,IL-6,IL-8,IL-10,IFN-γ和TNF-α的表達水平。探討HLA-G在胃癌

4、免疫逃逸中可能的作用機理。
　　 5.應用ELISA法對82例胃癌、52例淺表性胃炎、36例萎縮性胃炎、39例胃上皮內瘤變及67例健康體檢者血漿標本進行檢測,比較不同組間sHLA-G表達水平的差異及其與胃癌臨床病理特點間的關系,同時應用電化學發(fā)光法檢測CEA的表達水平。運用ROC曲線評估sHLA-G及CEA在胃癌早期診斷中的價值,將二者進行比較,探討sHLA-G在胃癌早期診斷及臨床應用中的價值。
　　 結果:
　　

5、 1.免疫組化染色結果顯示,胃癌組織中HLA-G的陽性表達率達49.7％(89/179),而癌旁正常胃組織中無表達(0/179),二者相比較有顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。HLA-G的陽性表達與胃癌的浸潤深度、鄰近臟器受侵及臨床分期顯著相關(P＜0.05),而與年齡、性別、腫瘤大小、Borrmann分期、淋巴結轉移、分化程度及淋巴結轉移無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。HLA-G陽性患者的5年總體生存率、腫瘤相關生存率及無病生存率均顯

6、著低于HLA-G陰性表達者(P＜0.05)。Cox回歸多因素分析的結果顯示HLA-G陽性表達是獨立的預后因素。腫瘤中Tregs的浸潤與胃癌的浸潤程度、淋巴結轉移、遠處臟器侵犯以及臨床分期相關(P＜0.05),而與年齡、性別、分化程度、腫瘤大小、Borrmann分期(P＞0.05)無統(tǒng)計學差異。Tregs高浸潤胃癌患者的5年總體生存率、腫瘤相關生存率及無病生存率均顯著低于低Tregs浸潤胃癌患者(P＜0.05)。Cox回歸多因素分析結果顯

7、示高Tregs浸潤是獨立的預后因素,且HLA-G的表達和Tregs的浸潤呈顯著相關。
　　 2.Western Blot結果顯示HLA-G在胃癌組織中出現(xiàn)陽性條帶,約39kDa大小,而對照組(癌旁正常組織)中均無條帶出現(xiàn),進一步證實HLA-G在胃癌組織中表達而在正常胃組織中不表達。
　　 3.HLA-G mRNA及蛋白在胃癌細胞系AGS、BGC-823、SGC-7901、MKN-45、MKN-28和HG-C-27中均低表

8、達;SGC-7901轉染HLA-G(SGC-7901-G)并穩(wěn)篩后,經檢測HLA-G mRNA及蛋白的表達水平均顯著升高。
　　 4.健康人PBMC與SGC-7901-G細胞系共培養(yǎng),與SG-C-7901-V共培養(yǎng)相比,共培養(yǎng)體系中CD3+CD25+FoxP3+T細胞顯著上調,同時,SGC-7901-G共培養(yǎng)體系上清中IL-6和IL-10顯著上調,TNF-α顯著下調。
　　 5.胃癌組血漿中sHLA-G(138.76U/

9、ml)表達水平均顯著高于胃上皮內瘤變組(57.28U/ml)、萎縮性胃炎組(55.55U/ml)、淺表性胃炎組(46.03U/m)及健康對照組(39.28U/ml)(P＜0.001);胃上皮內瘤變組血漿sHLA-G水平顯著高于健康對照組(P＜0.05);而胃上皮內瘤變與淺表性胃炎組、萎縮性胃炎組之間,淺表性胃炎組與萎縮性胃炎組之間以及淺表性胃炎組、萎縮性胃炎組與健康對照組之間差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。胃癌組血漿CEA水平顯著高

10、于其他各組(P＜0.01)。并且胃癌患者血漿sHLA-G水平與患者年齡及腫瘤大小顯著相關(P＜0.05),而與患者性別、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及臨床分期均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。sHLA-G診斷的ROC曲線AUC為0.814,顯著高于CEA的ROC曲線AUC0.692(P=0.01)。sHLA-G和CEA聯(lián)合檢測診斷的ROC曲線AUC為0.846,顯著高于sHIA-G或CEA(P＜0.001)。提示sHLA-G的診斷價值要

11、比CEA優(yōu)越,兩者聯(lián)合診斷優(yōu)于單獨診斷,結果具有更高的敏感性和特異性,從而進一步證實sHLA-G單獨或者與其他傳統(tǒng)標志物聯(lián)合應用有助于胃癌的早期診斷。
　　 結論:
　　 1.HLA-G在胃癌組織中的陽性表達顯著高于癌旁正常胃組織,HLA-G的陽性表達與胃癌患者的總體生存率、腫瘤相關生存率和無病生存率顯著相關,是影響預后的獨立因素,提示其在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。
　　 2.腫瘤組織中Tregs的浸潤

12、顯著高于正常組織,HLA-G陰性患者呈現(xiàn)Tregs低浸潤,相反,HLA-G陽性表達的患者呈現(xiàn)Tregs高浸潤,兩者呈顯著陽性相關。同時,Tregs浸潤與胃癌病變浸潤程度、淋巴結轉移、遠處器官侵犯以及臨床分期呈明顯相關。Tregs高浸潤患者的5年總體生存率、腫瘤相關生存率及無病生存率顯著低于Tregs低浸潤者。
　　 3.HLA-G過表達的胃癌細胞系SGC-7901與健康人PBMC共培養(yǎng)后,CD3+CD25+FoxP3+T細胞顯著