表皮葡萄球菌雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)SaeRS調(diào)控功能的研究.pdf

1、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)是寄居于人體皮膚表面常見的一種條件致病菌，通常并不致病。然而，隨著各種人工醫(yī)療材料(如人工瓣膜、靜脈留置管和導尿管等)的普遍使用，表皮葡萄球菌已成為引起醫(yī)院內(nèi)感染主要致病菌之一。表皮葡萄球菌能在醫(yī)療植入材料表面形成生物被膜(Biofilm)樣結構，而該結構具有抵抗抗生素治療和宿主免疫系統(tǒng)的作用，從而導致耐藥株產(chǎn)生及慢性感染。
　　 細菌能夠生存的首要前提是適應外

2、界環(huán)境，因此細菌必須具有感應外界環(huán)境信號的能力，并迅速將信號傳入菌體內(nèi)，從而啟動一系列相關基因的轉(zhuǎn)錄、表達以及表達產(chǎn)物的修飾，發(fā)揮相應的生物學功能。大多原核生物利用雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)(Two-component Signal Transduction Systems，TCSs)的機制進行信號轉(zhuǎn)導，調(diào)控其生物學特性。TCSs由組氨酸激酶(Histidine Kinase，HK)蛋白和反應調(diào)節(jié)蛋白(Response Regulator，RR

3、)組成，HK含有2個功能域，即HATPase_c和HisKA功能域。當外界信號作用于組氨酸激酶蛋白的膜外配體結合區(qū)時，激活激酶的ATP結合部位(HATPase_c domain)，HATPase_c功能域可結合、水解ATP為ADP，并將ATP的磷酸基團轉(zhuǎn)移到激酶HisKA功能域的組氨酸位點，使其發(fā)生自身磷酸化。隨后，反應調(diào)節(jié)蛋白調(diào)控區(qū)域能與磷酸化的組氨酸蛋白激酶相互作用，將激酶上的磷酸基團轉(zhuǎn)移到自身天冬氨酸位點上，發(fā)生自身磷酸化，并能激

4、活效應區(qū)，使其構像改變，暴露不同DNA結合位點，結合不同DNA序列產(chǎn)生一系列調(diào)控反應。
　　 已有的研究發(fā)現(xiàn)表皮葡萄球菌的生物膜形成分為兩個主要階段：單個細菌初始黏附到材料表面和細菌間的互相黏附形成多細胞層的結構，并且已發(fā)現(xiàn)了參與這兩個階段的一些生物膜相關基因(如atlE、ica、aap等)。目前已知在金葡菌中SaeRS調(diào)節(jié)毒力相關因子，比如SPA，Clumping factor等，而在表葡中其生物學作用及相關機制未見詳細報道。

5、
　　 TCSs廣泛存在于革蘭陽性菌和革蘭陰性菌中，其不僅參與細菌的基本生命活動，目前也發(fā)現(xiàn)它與很多病原菌的毒力和致病性密切相關。SaeRS在表皮葡萄球菌中的研究還知之甚少，故本論文在建立了表皮葡萄球菌雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)SaeRS刪除株的基礎上，對其生物學活性和介導自溶和生物膜形成相關機制進行了較全面的研究，并對胞外基質(zhì)中Aap蛋白及PIA重要成分在表皮葡萄球菌生物膜形成過程中的作用及進行了較深入的研究。借助于基因芯片和雙向電泳

6、技術，尋找潛在的受SaeRS調(diào)節(jié)的基因和蛋白，并對其生物學特性進行了研究。
　　 第一章表皮葡萄球菌saeRS基因刪除株的構建在金黃色葡萄球菌中研究發(fā)現(xiàn)SaeRS與細菌許多生物學功能有關，而其在表皮葡萄球菌中的生物學功能尚無報道。為了探討表皮葡萄球菌SaeRS雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的saeS基因和saeR基因刪除對細菌生物學功能的影響，我們構建了含有壯觀霉素抗性基因(spc)的saeRS刪除質(zhì)粒pMAD△saeRS，隨后將電轉(zhuǎn)入表皮

7、葡萄球菌1457菌株的重組質(zhì)粒在43℃條件下振搖培養(yǎng)，篩選saeRS缺失突變株，并對獲得的刪除突變株進行PCR、測序及生物化學反應試劑條鑒定，確證為表皮葡萄球菌1457 SaeRS缺失突變株(SE1457△saeRS)。
　　 不同的微生物宿主含有不同的復制起始子和抗性基因等，因此一種位點特異性的基因重組刪除基因的方法不可能適用于所有的細菌種類。在富含AT堿基的革蘭染色陽性的表皮葡萄球菌1457中利用質(zhì)粒pMAD定向刪除基因。p

8、MAD為穿梭質(zhì)粒，可在革蘭陰性的大腸埃希桿菌和革蘭陽性的葡萄球菌中擴增。因為自大腸埃希菌中抽提質(zhì)粒方法簡便，實驗流程往往是在大腸埃希菌中擴增pMAD重組質(zhì)粒后，再導入葡萄球菌。然而表皮葡萄球菌細胞不接受直接來自革蘭陰性桿菌的質(zhì)粒，而金黃色葡萄球菌RN4220是一種缺陷型革蘭陽性菌，可以接受來自革蘭陰性菌的質(zhì)粒。重組質(zhì)粒在金黃色葡萄球菌RN4220中經(jīng)過宿主菌的修飾后即可被表皮葡萄球菌細胞接受。本研究以雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)為目的基因，采用載

9、體pMAD構建重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)表皮葡萄球菌1457，篩選突變株。pMAD篩選方法簡便高效，只需一步篩選過程就可得到突變株，但pMAD質(zhì)粒較大(9.66 kb)，含多克隆位點較少，重組質(zhì)粒的構建和轉(zhuǎn)化比較困難。
　　 第二章表皮葡萄球菌saeRS基因刪除株生物學表型的研究為觀察saeRS刪除對細菌生物膜形成的影響，我們采用細菌生物膜微量板半定量方法檢測saeRS刪除突變對細菌生物被膜形成的影響，結果表明SE1457△saeRS株形成

10、生物被膜的能力明顯高于野生株。細菌初始黏附實驗檢測野生株和SE1457△saeRS株黏附到多聚物材料表面的能力，結果表明野生株和SE1457△saeRS株黏附到多聚物表面的能力沒有差異。通過檢測OD570值觀察其生長情況，結果顯示SE1457△saeRS株與野生株的生長曲線相似，saeRS基因刪除對細菌增殖無明顯影響。然而在細菌振蕩培養(yǎng)24h后檢測到SE1457△saeRS的CFU計數(shù)明顯低于野生株(大約降低logl CFU/ml)。進

11、而采用0.25％Triton X-100誘導細菌自溶的方法檢測SE1457△saeRS株和野生株自溶的差異，結果顯示SE1457△saeRS株的裂解率比野生株高達50％。
　　 為更好的觀察表皮葡萄球菌形成生物膜的內(nèi)部結構形態(tài)、成分分布及細菌狀態(tài)等，我們建立了激光共聚焦顯微鏡及掃描電鏡和透射電鏡觀察表皮葡萄球菌生物膜的體外培養(yǎng)系統(tǒng)。利用這些體外培養(yǎng)系統(tǒng)可以觀察表皮葡萄球菌生物膜中的微克隆，經(jīng)各種不同熒光染料的染色后可以在激光共聚

12、焦顯微鏡下清晰的觀察到生物膜的形態(tài)結構及內(nèi)部細菌的生理狀態(tài)。
　　 表皮葡萄球菌生物膜的形成及其調(diào)控是非常復雜的過程。表皮葡萄球菌生物膜的形成主要分為兩個階段：單個細菌初始黏附到材料表面；細菌之間互相黏附，形成多細胞層的結構。目前已發(fā)現(xiàn)了參與這兩個階段的一些功能基因(如atlE、icaADBC、aap、bap等)，其中icaADBC編碼細胞間多糖黏附素(PolysaccharideIntercellular Adhesion，P

13、IA)，而PIA是表皮葡萄球菌生物膜的主要成分之一，PIA在生物膜形成能力增強的SE1457△saeRS中產(chǎn)量也有明顯增加。通過SE1457△saeRS全蛋白的雙向電泳分析，我們得知Aap蛋白受SaeRS調(diào)節(jié)，提示Aap可能在SE1457△saeRS的生物膜形成中發(fā)揮了重要作用。通過基因芯片以等方法，發(fā)現(xiàn)參與生物膜形成第二階段的一些基因在突變株中的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，如phoR轉(zhuǎn)錄水平降低2.05倍。但凝膠遷移阻滯實驗(EMSA)未能證明

14、SaeR可以與phoPR的啟動子區(qū)特異性結合。
　　 第三章表皮葡萄球菌雙組分系統(tǒng)SaeRS刪除株表達譜和蛋白譜的比較分析基因芯片技術的基本原理是將大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強弱進而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。目前尚無商品化的表皮葡萄球菌基因芯片，本實驗室與Genomic ResearchLaboratory(Geneva，Switzerland)及上海基因芯片公司合作，以經(jīng)過測序并

15、注釋的表皮葡萄球菌ATCC12228和ATCC35984為基礎，設計引物通過PCR擴增出兩千三百多個ORF的DNA片段，并制作了cDNA芯片；對于不能擴增出DNA片段的約二百多個ORF，則合成寡核苷酸制作oligo芯片。
　　 本研究使用基因芯片對表皮葡萄球菌SE1457中的SaeRS雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)缺失后的基因表達譜的變化進行了分析。我們獲得了一些感興趣的已知與自溶能力有關的基因，如alpQ，arlR，lytS，lrgA等。

16、經(jīng)實時定量RT-PCR驗證，上述基因的表達變化水平與芯片結果很接近。使用蛋白組學技術對表皮葡萄球菌SE1457中的SaeRS雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)缺失后的蛋白表達譜的變化進行了分析，我們發(fā)現(xiàn)與生物膜形成有關的Aap蛋白(SE1457△saeRS突變株中表達上調(diào)10倍)。
　　 本論文通過構建表皮葡萄球菌SaeRS刪除株，研究SaeRS在表皮葡萄球菌中調(diào)控自溶以及生物膜形成中的作用，并通過基因芯片和蛋白組學方法研究受SaeRS調(diào)節(jié)的基