Spindlin1蛋白在小鼠卵細胞中的功能研究.pdf

1、紡錘體組裝檢測點(SAC)在哺乳動物體內，是一種普遍存在的、非常重要的調控機制。它在體細胞有絲分裂的過程中，可以防止出現(xiàn)染色體的不分離以及細胞的死亡。任何一條染色體未能正確附著在雙極紡錘體上都將激活該檢測點，使細胞分裂停滯在中期，從而為細胞修復這種錯誤贏得時間。在減數分裂中，紡錘體組裝檢測點同樣發(fā)揮著重要作用。已有研究證明，在有絲分裂中參與SAC調控的一些關鍵蛋白，如MAD、BUB等，在減數分裂中也發(fā)揮著相似的作用。盡管如此，作為一種特

2、殊的分裂形式，它的調控是否有別于體細胞的有絲分裂?是否存在著特殊的作用途徑?目前為止，這些問題都不清楚。而通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)了一種潛在的參與SAC調控的卵細胞特異的蛋白-spindlinl蛋白。 在前期工作中，本實驗室利用二維電泳和質譜鑒定等蛋白質組學技術建立了小鼠MetⅡ期(第二次減數分裂中期)卵細胞的蛋白表達譜。這部分數據可以通過下列網址直接訪問(http：//reprod.njmu.edu.cn/2d)。 Spindli

3、nl就是在該譜系中鑒定得到的蛋白之一。在這個譜系中，共有10個蛋白點被鑒定為spindlinl蛋白，它們分布于不同的分子量和等電點(高豐度的點大致集中在27kD和29kD兩個分子量水平)，這提示我們該蛋白在小鼠卵細胞中具有非常復雜的功能形式。在本次研究中，我們再次利用二維電泳獲得激活后卵細胞的2D膠，并與之前正常卵細胞的2D膠進行比對，結果發(fā)現(xiàn)位于29kD處的5個spindlinl蛋白點從激活后卵細胞的膠上消失，而位于27kD處的1個蛋

4、白點其表達則顯著上調。接著，我們用磷酸化染料對激活前卵細胞的2D膠進行染色，結果發(fā)現(xiàn)激活后消失的5個蛋白點均存在磷酸化形式。這說明spindlinl蛋白在卵細胞激活后存在去磷酸化的改變，這種改變可能導致該蛋白在卵細胞激活后喪失活性。 為了能夠進一步研究該蛋白的功能，我們通過傳統(tǒng)的原核表達、蛋白純化、動物免疫等方法獲得spindlinl抗體，并分別從Western blot、免疫組化、免疫熒光三個方面對抗體的特異性進行驗證。我們用

5、制得的抗體對純化的spindlinl蛋白進行Western blot檢測，結果在理論大小處獲得一條特異的融合蛋白目的條帶。另外免疫組化和免疫熒光的結果顯示，spindlinl蛋白主要定位在卵細胞的胞漿和紡錘體上，這與前人的報道一致。上述結果均證明，我們制備的spindlinl抗體是特異的并且是有效的。 本研究著重探討了spindlinl蛋白在小鼠卵細胞中表達、定位的變化以及與之相關的生物學功能。首先，我們通過Western bl

6、ot的方法研究激活前后卵細胞中spindlinl蛋白的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)該蛋白在激活前后卵細胞中的表達總量沒有改變。另外，免疫熒光的結果證明，該蛋白僅定位于卵細胞的中期紡錘體上，并且與α-tubulin蛋白共定位；而到分裂后期則從紡錘體上消失。這種定位的變化提示我們，spindlinl蛋白可能僅在分裂中期發(fā)揮作用。為了直接觀察該蛋白的生物學功能，我們利用顯微注射的方式將spindlinl的抗體導入MetⅡ期卵細胞胞漿中，進而觀察紡錘體的

7、形態(tài)以及染色體的分布。結果發(fā)現(xiàn)：正常的中期紡錘體結構被破壞，形成單極紡錘體、長形紡錘體、橢圓形紡錘體；同時出現(xiàn)了嚴重的染色體排列紊亂。該結果有力地證明，在MetⅡ期卵細胞中，spindlinl是維持紡錘體形態(tài)以及染色體排列的一種重要蛋白。接著，我們用氯化鍶激活注射后的卵細胞，并通過活細胞工作站適時觀察分裂的進程。結果顯示抗體組卵細胞其后期啟動以及第二極體排放的速度均明顯快于對照組。 根據上述一系列研究結果，我們推斷spindli