Spindlin1蛋白在小鼠卵細(xì)胞中的功能研究.pdf

1、紡錘體組裝檢測點(SAC)在哺乳動物體內(nèi)，是一種普遍存在的、非常重要的調(diào)控機制。它在體細(xì)胞有絲分裂的過程中，可以防止出現(xiàn)染色體的不分離以及細(xì)胞的死亡。任何一條染色體未能正確附著在雙極紡錘體上都將激活該檢測點，使細(xì)胞分裂停滯在中期，從而為細(xì)胞修復(fù)這種錯誤贏得時間。在減數(shù)分裂中，紡錘體組裝檢測點同樣發(fā)揮著重要作用。已有研究證明，在有絲分裂中參與SAC調(diào)控的一些關(guān)鍵蛋白，如MAD、BUB等，在減數(shù)分裂中也發(fā)揮著相似的作用。盡管如此，作為一種特

2、殊的分裂形式，它的調(diào)控是否有別于體細(xì)胞的有絲分裂?是否存在著特殊的作用途徑?目前為止，這些問題都不清楚。而通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)了一種潛在的參與SAC調(diào)控的卵細(xì)胞特異的蛋白-spindlinl蛋白。 在前期工作中，本實驗室利用二維電泳和質(zhì)譜鑒定等蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)建立了小鼠MetⅡ期(第二次減數(shù)分裂中期)卵細(xì)胞的蛋白表達(dá)譜。這部分?jǐn)?shù)據(jù)可以通過下列網(wǎng)址直接訪問(http：//reprod.njmu.edu.cn/2d)。 Spindli

3、nl就是在該譜系中鑒定得到的蛋白之一。在這個譜系中，共有10個蛋白點被鑒定為spindlinl蛋白，它們分布于不同的分子量和等電點(高豐度的點大致集中在27kD和29kD兩個分子量水平)，這提示我們該蛋白在小鼠卵細(xì)胞中具有非常復(fù)雜的功能形式。在本次研究中，我們再次利用二維電泳獲得激活后卵細(xì)胞的2D膠，并與之前正常卵細(xì)胞的2D膠進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于29kD處的5個spindlinl蛋白點從激活后卵細(xì)胞的膠上消失，而位于27kD處的1個蛋

4、白點其表達(dá)則顯著上調(diào)。接著，我們用磷酸化染料對激活前卵細(xì)胞的2D膠進(jìn)行染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)激活后消失的5個蛋白點均存在磷酸化形式。這說明spindlinl蛋白在卵細(xì)胞激活后存在去磷酸化的改變，這種改變可能導(dǎo)致該蛋白在卵細(xì)胞激活后喪失活性。 為了能夠進(jìn)一步研究該蛋白的功能，我們通過傳統(tǒng)的原核表達(dá)、蛋白純化、動物免疫等方法獲得spindlinl抗體，并分別從Western blot、免疫組化、免疫熒光三個方面對抗體的特異性進(jìn)行驗證。我們用

5、制得的抗體對純化的spindlinl蛋白進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果在理論大小處獲得一條特異的融合蛋白目的條帶。另外免疫組化和免疫熒光的結(jié)果顯示，spindlinl蛋白主要定位在卵細(xì)胞的胞漿和紡錘體上，這與前人的報道一致。上述結(jié)果均證明，我們制備的spindlinl抗體是特異的并且是有效的。 本研究著重探討了spindlinl蛋白在小鼠卵細(xì)胞中表達(dá)、定位的變化以及與之相關(guān)的生物學(xué)功能。首先，我們通過Western bl

6、ot的方法研究激活前后卵細(xì)胞中spindlinl蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白在激活前后卵細(xì)胞中的表達(dá)總量沒有改變。另外，免疫熒光的結(jié)果證明，該蛋白僅定位于卵細(xì)胞的中期紡錘體上，并且與α-tubulin蛋白共定位；而到分裂后期則從紡錘體上消失。這種定位的變化提示我們，spindlinl蛋白可能僅在分裂中期發(fā)揮作用。為了直接觀察該蛋白的生物學(xué)功能，我們利用顯微注射的方式將spindlinl的抗體導(dǎo)入MetⅡ期卵細(xì)胞胞漿中，進(jìn)而觀察紡錘體的

7、形態(tài)以及染色體的分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常的中期紡錘體結(jié)構(gòu)被破壞，形成單極紡錘體、長形紡錘體、橢圓形紡錘體；同時出現(xiàn)了嚴(yán)重的染色體排列紊亂。該結(jié)果有力地證明，在MetⅡ期卵細(xì)胞中，spindlinl是維持紡錘體形態(tài)以及染色體排列的一種重要蛋白。接著，我們用氯化鍶激活注射后的卵細(xì)胞，并通過活細(xì)胞工作站適時觀察分裂的進(jìn)程。結(jié)果顯示抗體組卵細(xì)胞其后期啟動以及第二極體排放的速度均明顯快于對照組。 根據(jù)上述一系列研究結(jié)果，我們推斷spindli