小鼠肝臟細(xì)胞可變剪接模式解析及Tak1蛋白亞型功能研究.pdf

1、可變剪接是Pre-mRNA按不同的剪接方式形成不同成熟mRNA轉(zhuǎn)錄本的過程。在人類中多達(dá)95％的多外顯子基因能夠發(fā)生可變剪接，其對于蛋白質(zhì)組的多樣性和復(fù)雜性的形成具有重要的貢獻(xiàn)。而肝臟是哺乳動物體內(nèi)最大的代謝器官，由實(shí)質(zhì)細(xì)胞及非實(shí)質(zhì)細(xì)胞（包括肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、枯否細(xì)胞、肝星形細(xì)胞及幾種數(shù)量較為稀少的細(xì)胞）組成，各型細(xì)胞間的相互協(xié)作是肝臟發(fā)揮各項(xiàng)生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。因此，能夠同時關(guān)注多個細(xì)胞類型的組學(xué)研究在揭示肝臟生物學(xué)本質(zhì)時具有巨大的優(yōu)勢。<

2、br>　　本課題在前人工作的基礎(chǔ)上，利用RNA-Seq技術(shù)對小鼠肝臟四種類型細(xì)胞（實(shí)質(zhì)細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、枯否細(xì)胞、星形細(xì)胞）的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全面測序，詳細(xì)論述了各類細(xì)胞特異的基因表達(dá)模式及可變剪接模式，探索可變剪接對細(xì)胞功能的調(diào)控原理，同時解析了剪接因子與可變剪接事件之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并以Tak1基因的可變剪接為例，論述基因通過可變剪接這一機(jī)制調(diào)控其蛋白亞型發(fā)揮細(xì)胞特異性功能的具體機(jī)制。
　　本研究在全部四種細(xì)胞中共鑒定到12,947

3、個基因，其中8,491個基因（占65.6%）在全部細(xì)胞中均有表達(dá)。GO分析顯示，各細(xì)胞中高表達(dá)的基因富集于細(xì)胞特異性功能相關(guān)的條目上，如實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的高表達(dá)基因主要富集于氧化還原及物質(zhì)代謝的過程；而在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中，主導(dǎo)細(xì)胞粘附與血管形成的基因呈高表達(dá)狀態(tài)；枯否細(xì)胞中免疫響應(yīng)與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因高表達(dá)；而星形細(xì)胞也顯示出其與與肝臟的纖維化進(jìn)程具有密切的聯(lián)系。我們的數(shù)據(jù)從轉(zhuǎn)錄組的層面上同時展示了四種細(xì)胞的功能特征，對蛋白質(zhì)組水平的研究進(jìn)行了極

4、大的補(bǔ)充和完善。值得注意的是，若干代謝相關(guān)的基因（如大分子物質(zhì)代謝相關(guān)等）同樣富集于非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中，這是肝臟細(xì)胞間存在代謝協(xié)作過程的有力證據(jù)。
　　細(xì)胞的可變剪接模式是本研究關(guān)注的重點(diǎn)，我們的數(shù)據(jù)共檢測到小鼠肝臟細(xì)胞46.2%的多外顯子基因發(fā)生了可變剪接，覆蓋數(shù)據(jù)庫中已知可變剪接事件總數(shù)的81.5%，證明肝臟內(nèi)存在著較為頻繁的可變剪接調(diào)控。此外，我們的數(shù)據(jù)還鑒定到來自1,009條基因的1,189次新的可變剪接事件，對現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫信息進(jìn)

5、行了補(bǔ)充。外顯子跳躍是最主要的可變剪接形式，占到全部可變剪接事件的70%以上，但四種細(xì)胞中各類型剪接事件的頻率較為相近。編碼調(diào)節(jié)因子、轉(zhuǎn)錄因子及蛋白激酶的基因受可變剪接調(diào)控的比例最高，這可能是可變剪接能夠造成下游廣泛生物學(xué)改變的原因所在。從細(xì)胞的功能特征上看，發(fā)生可變剪接的基因顯著富集于細(xì)胞的主體功能上：實(shí)質(zhì)細(xì)胞專職于某一代謝功能的完成，而非實(shí)質(zhì)細(xì)胞除完成各自細(xì)胞特異的功能外，還承擔(dān)了對各類代謝功能進(jìn)行調(diào)控的任務(wù)，如富集于“Positi

6、ve Regulation of Metabolic Process”等條目上，表明可變剪接是一種在轉(zhuǎn)錄調(diào)控基礎(chǔ)上的更加精細(xì)的功能調(diào)控方式，是細(xì)胞特異性形成的重要原因。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中具有最多數(shù)量的可變剪接事件，這可能與其特殊的解剖位置、生理功能及與其它細(xì)胞間存在大量的Crosstalk有關(guān)。
　　我們進(jìn)一步鑒定并驗(yàn)證了四種細(xì)胞中的細(xì)胞特異性外顯子，發(fā)現(xiàn)包含有細(xì)胞特異性外顯子的基因與細(xì)胞的核心功能密切相關(guān)，其可變剪接模式主導(dǎo)了細(xì)胞間

7、功能差異的形成；從整體的層面上看，細(xì)胞特異性外顯子并不傾向于富集在具有明確功能的蛋白核心結(jié)構(gòu)域上，而是大量位于無序結(jié)構(gòu)中。肽段形成的無序結(jié)構(gòu)往往對蛋白間的相互作用有較大影響，而眾多包含有細(xì)胞特異性外顯子的無序結(jié)構(gòu)也確實(shí)形成了蛋白間的結(jié)合區(qū)域，因此，通過影響蛋白間的相互作用可能是可變剪接影響蛋白功能的主要途徑。此外，細(xì)胞特異性外顯子對應(yīng)的肽段中還包含有更多的翻譯后修飾位點(diǎn)，這也可能是可變剪接造成功能改變的途徑之一。
　　剪接因子是可

8、變剪接的上游調(diào)控者，對細(xì)胞特異性可變剪接模式的形成起到?jīng)Q定性的作用。我們篩選了各細(xì)胞中相對高表達(dá)的剪接因子，如實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的Esrp2與枯否細(xì)胞中的Srsf9等。GO分析發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞特異性剪接因子能夠調(diào)控大多數(shù)的細(xì)胞特異性可變剪接事件，其靶基因與各自類型細(xì)胞的核心功能關(guān)系密切。為全面闡述剪接因子的調(diào)控規(guī)律，我們構(gòu)建了小鼠肝臟細(xì)胞背景下的“Splicing Map”，重點(diǎn)展現(xiàn)剪接因子與可變外顯子之間復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，總結(jié)了剪接因子類型、細(xì)胞種

9、類、motif位置等諸多因素對最終調(diào)控效應(yīng)的影響。值得注意的是，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中擁有最多數(shù)量的可變剪接事件，同時也富集到了最多的剪接因子對其進(jìn)行調(diào)控，表明肝竇內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)存在著活躍的剪接調(diào)控過程，提示可變剪接對細(xì)胞功能調(diào)控及對細(xì)胞特性形成具有重要的作用。
　　可變剪接的功能最終仍然需要分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的確證，因此，我們以Tak1基因?yàn)槔?，論述可變剪接如何對蛋白亞型的?xì)胞特異性功能進(jìn)行調(diào)控。Tak1存在兩個常見亞型，Tak1-B存在于實(shí)質(zhì)

10、細(xì)胞中，而三種非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中則以Tak1-A亞型為主。Tak1-A的功能主要富集于免疫相關(guān)的條目中，而Tak1-B則與基礎(chǔ)的氨基酸合成及脂質(zhì)代謝等過程關(guān)系密切。Co-IP實(shí)驗(yàn)顯示，Tak1-A更容易與Tab2結(jié)合，同時其下游的JNK、p38及NF-κB通路的磷酸化程度更高。JNK、p38通路與細(xì)胞內(nèi)的免疫及炎癥過程密切相關(guān)，這與Tak1-A在非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的分布及功能相符。同時，將Tak1-B轉(zhuǎn)換為Tak1-A后，與脂質(zhì)代謝相關(guān)的若干基因的

11、表達(dá)也發(fā)生顯著變化，表明Tak1-A失去了Tak1-B對脂質(zhì)代謝過程的調(diào)控作用。另外，異常的免疫應(yīng)激狀態(tài)與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，而我們同樣在臨床肝癌樣本中檢測到了 Tak1-A比例的異常升高，但這一可變剪接事件是否確實(shí)影響肝癌的發(fā)生尚未能確定，其具體機(jī)制也需要進(jìn)一步的深入研究。
　　綜上所述，本研究通過對小鼠肝臟四種類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測序，總結(jié)并詳細(xì)討論了細(xì)胞類型特異的基因表達(dá)模式及可變剪接模式，認(rèn)為可變剪接的整體調(diào)控是肝臟細(xì)胞間功能

12、特異性形成的重要原因，是一種相較于轉(zhuǎn)錄調(diào)控及蛋白表達(dá)調(diào)控的更加精準(zhǔn)的調(diào)控方式，揭示了小鼠肝臟細(xì)胞構(gòu)成的生物學(xué)原理。細(xì)胞特異的可變剪接事件決定細(xì)胞的核心功能，這主要是通過影響蛋白間的相互作用及翻譯后修飾而實(shí)現(xiàn)的。剪接因子的調(diào)控對細(xì)胞特異性可變剪接模式的形成至關(guān)重要，其間包含了剪接因子種類、motif位置、細(xì)胞類型等多種影響因素，是細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境綜合作用的結(jié)果。最終，我們以Tak1基因?yàn)槔敿?xì)闡述了可變剪接調(diào)控蛋白亞型功能以適應(yīng)不同類型細(xì)胞