紡錘體相關(guān)蛋白spindlin1與甲基化組蛋白復合物的結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、本文利用結(jié)構(gòu)生物學手段對紡錘體相關(guān)蛋白 spindlin1與其甲基化的組蛋白多肽底物所形成的復合物結(jié)構(gòu)進行了研究。采用原核細胞大量表達的體外重組蛋白，構(gòu)建了spin基因的原核細胞表達載體pET28a/SUMO和pGEX-2T，根據(jù)表達結(jié)果，確認了能夠得到大量帶有his-SUMO標簽和GST標簽的可溶性重組spindlin1。
　　在 LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的大腸桿菌表達菌株 BL21(DE3)中進行了目的蛋白的大規(guī)模表達。電泳檢測結(jié)果表明

2、，在常規(guī)培養(yǎng)和誘導條件下（37℃培養(yǎng)；16℃，0.3mmol/L IPTG誘導表達），可以得到較為理想的重組目的蛋白。
　　利用柱式層析方法分離純化了目的蛋白，確立了穩(wěn)定可重復的純化策略，即親和層析→陰離子交換層析→凝膠過濾層析，得到了結(jié)晶純、高濃度（約24mg/mL或0.9mmol/L）的目的蛋白溶液，并用于結(jié)晶實驗。
　　用純化的目的蛋白產(chǎn)物進行結(jié)晶條件的篩選和優(yōu)化，最終，確立了穩(wěn)定可重復且能夠形成高質(zhì)量晶體的結(jié)晶條件，

3、即：0.1mol/L CAPS，pH=11；2.0mol/L（NH4）2SO4；0.2mol/L Li2SO4；0.1mol/L Glycine，得到的蛋白質(zhì)晶體適合于衍射實驗。
　　在上海同步輻射光源，利用X射線衍射法分析蛋白質(zhì)復合物晶體，收集到了一套分辨率達到2.4?的衍射數(shù)據(jù)，并據(jù)此初步解析并修正了spindlin1和它的結(jié)合底物H3K4me3多肽復合物的三維結(jié)構(gòu)。通過結(jié)構(gòu)模型得到了關(guān)于二者相互作用的詳細信息，即：spind

4、lin1的第二個tudor結(jié)構(gòu)域參與識別和結(jié)合三甲基化的賴氨酸殘基，其中spindlin1上至關(guān)重要的氨基酸殘基位點是（從N-端開始） Phe116，Trp126，Tyr145，Tyr152等四個帶有芳香環(huán)的殘基；spindlin1上的殘基 Tyr154和三甲基化的賴氨酸殘基之間通過氫鍵穩(wěn)定相互作用；spindlin1第二個tudor結(jié)構(gòu)域中的殘基Asp159和組蛋白多肽上的殘基Arg2之間通過鹽鍵穩(wěn)定相互作用；組蛋白H3K4me3多肽