豬繁殖與呼吸綜合征病毒自殺性DNA疫苗及其菌蛻復合疫苗的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的傳染病。PRRSV GP5目前被認為是研制PRRS新型分子診斷試劑和新型疫苗的良好材料?！白詺⑿浴盌NA疫苗不僅具有常規(guī)DNA疫苗易制備、運輸、保存等優(yōu)點，還具有安全性與有效性。菌蛻是沒有細胞內(nèi)容物的革蘭氏陰性菌的細胞膜，它可以靶向于免疫系統(tǒng)并作為免疫佐劑。另外，菌蛻可作為呈遞蛋白、藥物、DNA、和其他水溶物的載體。鑒于此，本課題以菌蛻作為載體，

2、與表達PRRSV ORF5基因的“自殺性”DNA疫苗制備成PRRSV“自殺性”DNA菌蛻復合疫苗，再進行小白鼠的免疫試驗。主要研究內(nèi)容如下： 通過RT—PCR擴增采自重慶地區(qū)不同豬場高熱病病豬肺組織樣本中PRRSV的ORF5全序列，并將該序列克隆進pMD18—T載體進行測序。結(jié)果8個樣本中有5個成功擴增出大小為603bp的ORF5全序列。系統(tǒng)進化分析表明它們與國內(nèi)2006-2007年間的分離株親緣關系較近，而與更早的分離株和疫苗

3、株MLV親緣關系較遠。此外，推導氨基酸序列分析表明：重慶地區(qū)流行的PRRSV與以JXA1等為代表的同期其它地區(qū)分離株相比較，在ORF5的兩個線性抗原表位中存在獨特性變異。 將測序后的ORF5用帶有酶切位點的引物擴增，再克隆進pMD18—T載體。經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定后，再亞克隆到“自殺性”DNA疫苗載體pSMART2a上。菌落PCR和酶切鑒定證明重組質(zhì)粒pSMART—ORF5包含完整的ORF5基因，成功構(gòu)建PRRSV自殺性DNA

4、疫苗。 將凍干的菌蛻重懸于含質(zhì)粒pSMART—ORF5的PBS緩沖液中。用PBS洗滌沉淀5次，分別測定五次上清的OD260，以確定裝入菌蛻的pDNA量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：孵育10min已足夠，延長裝載時間(至3h)，不會增加裝載量。最后裝入菌蛻的量約為最初投入量的12％。 在PCR擴增及TA克隆后，將編碼N端缺失30個氨基酸殘基的tORF5(truncated ORF5)序列亞克隆至原核表達質(zhì)粒pRSETA上。誘導后，tORF5

5、在大腸桿菌BL21里的表達產(chǎn)物經(jīng)過SDS—PAGE分析，證實為tGP5與6聯(lián)組氨酸(6×His)的融合蛋白，分子量約為23kDa，表達量占菌體總蛋白的15％，主要以包涵體形式存在。 用自殺性DNA疫苗及菌蛻復合疫苗注射的小鼠后，用間接ELISA方法測定其血清里的抗體水平。試驗結(jié)果初步說明相比PRRSV自殺性DNA疫苗，PRRSV自殺性DNA菌蛻復合疫苗可以刺激機體產(chǎn)生更為有效的體液免疫反應。并且相比肌肉注射PRRSV自殺性DNA