HBV S-ecdCD40L融合基因修飾對(duì)樹突狀細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的： 1.利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建HBV S-ecdCD40L融合基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1-S-ecdCD40L，并利用軟件對(duì)其相應(yīng)融合蛋白(HBsAg-ecdCD40L)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性進(jìn)行預(yù)測。 2.探討HBV S-ecdCD40L融合基因修飾對(duì)樹突狀細(xì)胞(DC)功能的影響。 方法： 1.利用HBV S基因及CD40L胞外段基因特異性引物，擴(kuò)增HBV S基因及CD40L胞外段基因全長序列

2、，兩段基因通過酶切連接構(gòu)建HBV S-ecdCD40L融合基因并通過PCR擴(kuò)增，融合基因定向插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-S-ecdCD40L，并經(jīng)酶切和測序分析鑒定。 2.應(yīng)用Gene Construction kit2.5、DNAStar軟件和www.expasy.org網(wǎng)站提供的分析方案分析重組質(zhì)粒的開放讀框以及融合蛋白HBsAg-ecdCD40L的柔性、親水性、抗原性、表位等性

3、質(zhì)，并作了二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬分析。 3.密度梯度離心法分離健康成人外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入含GM-CSF和IL-4的RPMI-1640培養(yǎng)液聯(lián)合誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞分化，分別以倒置顯微鏡、掃描電子顯微鏡觀察DC形態(tài)變化。DC誘導(dǎo)培養(yǎng)第5天，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，共分為4組，A組為pcDNA3.1-S-ecdCD40L轉(zhuǎn)染組，B組為pcDNA3.1-S轉(zhuǎn)染組，C組為pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組，D組為PBS對(duì)照組。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集DC及其上清，流

4、式細(xì)胞術(shù)檢測DC表面CD80、CD86、HLA-DR的表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測DC上清中IL-12p70的分泌水平，CCK-8法檢測混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中DC刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力。 結(jié)果： 1.經(jīng)酶切和測序證明成功構(gòu)建pcDNA3.1-S-ecdCD40L重組質(zhì)粒。 2.HBV S-ecdCD40L融合基因序列與設(shè)計(jì)一致，重組質(zhì)粒讀框正確。融合蛋白HBsAg-ecdCD40L的氨基酸序列

5、通過軟件分析，并與HBsAg和JCD40L胞外段氨基酸序列軟件分析結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)在二級(jí)結(jié)構(gòu)上幾乎沒有變化，親水性、抗原性等生物學(xué)活性也幾乎未受影響，Linker部位具有抗原性低、中性、柔性高等特點(diǎn)，不影響兩端的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及融合蛋白空間構(gòu)象。 3.分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)GM-CSF、IL-4等細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)，成功培養(yǎng)出具有典型形態(tài)特征的樹突狀細(xì)胞。掃描電鏡下見細(xì)胞表面大量褶皺和粗細(xì)不等的樹枝樣突起。 4.流式細(xì)胞術(shù)

6、檢測DC表面分子CD80、CD86、HLA-DR表達(dá)結(jié)果：DC表面CD80、CD86、HLA-DR的表達(dá)水平，A組(分別為59.88±14.39％、98.06±2.03％、75.89±13.06％)高于B組(分別為40.72±11.16％、94.68±1.95％、58.50±15.02％)，差異均有顯著性(P<0.05)；C組和D組的CD80、CD86、HLA-DR表達(dá)水平(分別為35.58±5.55％、94.08±4.00％、54.0

7、6±15.71％和33.92±8.85％、93.98±3.71％、53.65±19.60％)，均顯著低于A組(P<0.05)；B組CD80、CD86、HLA-DR表達(dá)水平略高于C組、D組，但差異無顯著性(P>0.05)；C組和D組差異無顯著性(P>0.05)。 5.ELISA檢測DC分泌IL-12p70水平結(jié)果：DC分泌IL-12p70水平，A組(195.40±73.19pg/ml)高于B組(137.92±56.41pg/ml)

8、，差異有顯著性(P<0.05)；C組和D組(分別為124.35±36.12pg/ml和122.80±40.07pg/ml)，均顯著低于A組(P<0.05)；B組IL-12p70分泌水平略高于C組和D組，但差異均無顯著性(P>0.05)；C組和D組差異無顯著性(P>0.05)。 6.CCK-8法檢測混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中DC剌激同種異體淋巴細(xì)胞增殖能力結(jié)果：DC剌激淋巴細(xì)胞增殖的能力隨著DC/T比例的增高而增強(qiáng)。當(dāng)DC/T比值為1：5

9、、1：10時(shí)，A組的刺激指數(shù)(分別為3.28±0.79、2.95±0.52)高于B組(分別為2.51±0.70、2.38±0.60)，差異有顯著性(P<0.05)；C組和D組的刺激指數(shù)(分別為2.25±0.57、2.14±0.50和2.37±0.65、2.24±0.48)，均顯著低于A組(P<0.05)；B組的刺激指數(shù)略高于C組、D組，但差異無顯著性(P>0.05)；C組和D組差異無顯著性(P>0.05)。當(dāng)DC/T比值為1：20時(shí)，4

10、組刺激指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建HBV S-ecdCD40L融合基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1-S-ecdCD40L。 2.重組質(zhì)粒設(shè)計(jì)合理，融合蛋白HBsAg-ecdCD40L很大程度保留了HBsAg和CD40L胞外段的生物學(xué)活性。 3.HBV S-ecdCD40L融合基因修飾可活化DC，促進(jìn)DC成熟，增強(qiáng)DC功能，表現(xiàn)為，與對(duì)照組相比，HBV S-ecdCD40L融合基因