Ag85A基因修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗抗膀胱癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤。膀胱腫瘤的發(fā)生和復(fù)發(fā)主要與機(jī)體免疫功能低下、腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)視有關(guān)，如何提高膀胱腫瘤患者的免疫功能成為治療和預(yù)防膀胱腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵，因而腫瘤的免疫治療方法越來(lái)越受關(guān)注。腫瘤特異性免疫治療的基礎(chǔ)是腫瘤細(xì)胞具有抗原性并能引起機(jī)體的免疫應(yīng)答?？鼓[瘤免疫主要是T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，有效的抗原提呈，是機(jī)體抗腫瘤免疫的始動(dòng)因素。腫瘤細(xì)胞由于MHC-Ⅰ類分子表達(dá)低下及共刺激分子的缺乏，導(dǎo)

2、致自身提呈抗原能力低下，腫瘤特異性T細(xì)胞的激活必需依賴于抗原提呈細(xì)胞的幫助。樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell DC)是體內(nèi)唯一能夠激活初始T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞，是啟動(dòng)、調(diào)控并維持免疫應(yīng)答的重要環(huán)節(jié)。有研究表明，惡性腫瘤細(xì)胞在患者體內(nèi)釋放的免疫抑制因子能抑制DC的生物學(xué)活性，使其不能有效提呈腫瘤抗原激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的逃逸。更有實(shí)驗(yàn)證實(shí)在膀胱腫瘤組織中浸潤(rùn)的DC成熟受抑，共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)下調(diào)，可能

3、是其發(fā)生免疫逃逸的機(jī)制之一。因此研究以DC為基礎(chǔ)的DC疫苗免疫治療方法將成為膀胱腫瘤治療和預(yù)防復(fù)發(fā)的有效手段。
　　 制備DC疫苗的基本方法是將腫瘤抗原負(fù)載DC。而DC疫苗有效性的首要前提是DC具有正常的生物學(xué)功能。促進(jìn)DC的成熟、增強(qiáng)其功能則是提高DC疫苗免疫效果的重要手段。將細(xì)胞因子基因?qū)隓C或通過(guò)細(xì)菌DNA序列CpG刺激、HSP沖激DC等方法均能促進(jìn)DC的成熟，從而促進(jìn)其抗原提呈功能，提高DC疫苗免疫效果。Morales

4、將BCG經(jīng)膀胱灌注用于膀胱癌的治療取得了成功。Tokunaga等發(fā)現(xiàn)從BCG中提取的DNA片段具有抗腫瘤活性。研究還發(fā)現(xiàn)從BCG中提取的Ag85復(fù)合物具有較強(qiáng)的免疫刺激活性。其中Ag85ADNA疫苗可刺激機(jī)體Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α等的產(chǎn)生水平升高；促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的細(xì)胞毒活性，增強(qiáng)NK細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞的腫瘤殺傷活性。Ag85A基因轉(zhuǎn)染的DC疫苗已用于抗結(jié)核的實(shí)驗(yàn)研究，但以此轉(zhuǎn)染的DC疫苗用于膀胱

5、癌的研究國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。本研究構(gòu)建了Ag85A真核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞株DC2.4，觀察Ag85A基因轉(zhuǎn)染的DC免疫生物學(xué)特性的變化，并以Ag85A基因修飾的DC2.4負(fù)載膀胱腫瘤抗原制備DC疫苗，觀察其在體內(nèi)外對(duì)膀胱腫瘤的免疫學(xué)效應(yīng)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、重組質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化經(jīng)PCR擴(kuò)增的目的基因Ag85A與載體pcDNA3.1/myc-hisA連接后轉(zhuǎn)

6、化到大腸桿菌E.coli DH5α，提取質(zhì)粒經(jīng)酶切電泳鑒定和測(cè)序證實(shí)。
　　 2、重組質(zhì)rpcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A轉(zhuǎn)染DC2.4采用lipofectamine2000進(jìn)行pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DC2.4，同時(shí)設(shè)pcDNA3.1/myc-hisA空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染DC2.4作為對(duì)照。48h后收獲瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后按篩選試驗(yàn)中所確定的最佳G418濃度(500μg

7、/ml)加入G418進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選，持續(xù)篩選3周后獲穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，即DC-Ag85A、DC-pcDNA。
　　 3、RT-PCR法檢測(cè)瞬時(shí)及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染DC中Ag85A mRNA表達(dá)瞬時(shí)及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染DC樣品抽提總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)Ag85A基因的mRNA表達(dá)。
　　 4、MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染DC刺激T細(xì)胞增殖能力轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重組質(zhì)粒、pcDNA3.1/myc-hisA空質(zhì)粒和

8、未轉(zhuǎn)染的DC2.4細(xì)胞，加入絲裂霉素C滅活，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105/ml，作為刺激細(xì)胞。制備C57BL/6小鼠脾細(xì)胞懸液，紅細(xì)胞裂解液溶解紅細(xì)胞，尼龍毛柱分離T淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml，作為反應(yīng)細(xì)胞。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞各100μl，分別于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h、72h和96h，MTT法檢測(cè)。
　　 5、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染DC膜表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ

9、表達(dá)水平上述轉(zhuǎn)染的各組DC，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入到FACS測(cè)定管中，各管分別加入抗-CD80-PE單克隆抗體、抗-CD86-PE單克隆抗體、抗-MHCⅡ-PE單克隆抗體冰浴30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
　　 6、MB49粗提抗原及負(fù)載腫瘤抗原DC疫苗的制備收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MB49細(xì)胞，反復(fù)凍融離心，取上清，制備粗提抗原。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的DC-Ag85A、DC-pcDNA和DC2.4接種于6孔細(xì)胞

10、培養(yǎng)板，然后加入MB49粗提抗原，37℃、5%CO2培養(yǎng)48h負(fù)載抗原。制成DC-Ag85A疫苗、DC-pcDNA疫苗和DC2.4疫苗。
　　 7、MTT法檢測(cè)DC疫苗刺激的效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)MB49細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)上述DC疫苗及未負(fù)載腫瘤抗原的DC2.4細(xì)胞，加入絲裂霉素C，37℃30min滅活。滅活的DC按照1:10的比例與分離的C57BL/6小鼠脾T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，并以未經(jīng)DC刺激的T淋巴細(xì)胞作為對(duì)照。培養(yǎng)72h收集懸浮細(xì)胞即為

11、DC疫苗刺激的效應(yīng)T細(xì)胞。以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MB49細(xì)胞作為靶細(xì)胞，濃度為4×105/ml。按效：靶等于10:1加入96孔板，同時(shí)以單純效應(yīng)細(xì)胞和單純靶細(xì)胞作對(duì)照，培養(yǎng)72h，MTT法檢測(cè)。
　　 8、ELISA檢測(cè)負(fù)載腫瘤抗原DC疫苗刺激的效應(yīng)T細(xì)胞分泌IFN-γ水平采用ELISA法對(duì)上述各組DC疫苗刺激的效應(yīng)細(xì)胞上清IFN-γ的含量進(jìn)行檢測(cè)，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處OD值，應(yīng)用SoftMax Pr04.3.1 LS軟件分析，繪制標(biāo)

12、準(zhǔn)品曲線，計(jì)算樣品中IFN-γ的含量。
　　 9、MB49皮下移植瘤動(dòng)物模型的建立和分組及其免疫M(jìn)B49細(xì)胞1×107/ml，第0天注射1×106細(xì)胞于待實(shí)驗(yàn)的C57BL/6小鼠背部皮下。24只小鼠共分為4組，即DC-Ag85A疫苗組、DC-pcDNA疫苗組、DC2.4疫苗組和PBS對(duì)照組，每組6只，雌雄各半，分別在接種腫瘤細(xì)胞后的第1、7和14天于每只小鼠的接種腫瘤部位局部注射DC-Ag85A疫苗、DC-pcDNA疫苗、DC2

13、.4疫苗和PBS0.1ml，DC細(xì)胞數(shù)為1×106。
　　 10、腫瘤生長(zhǎng)情況的檢測(cè)接種后每天觀察腫塊的形成情況，記錄潛伏期。第21天處死小鼠剝離腫瘤，測(cè)量腫塊的長(zhǎng)徑a和短徑b，計(jì)算腫瘤體積。同時(shí)稱取腫瘤重量。分別計(jì)算重量和體積抑瘤率。
　　 11、腫瘤組織切片病理學(xué)檢查剝離小鼠皮下腫瘤組織做常規(guī)組織切片，H-E染色，光鏡觀察組織病理學(xué)改變。
　　 12、免疫組化分析腫瘤組織中浸潤(rùn)T細(xì)胞亞群上述組織切片用抗-CD

14、4和抗-CD8單克隆抗體進(jìn)行免疫組化染色，分析腫瘤組織中浸潤(rùn)T細(xì)胞亞群。
　　 13、流式細(xì)胞儀檢測(cè)荷瘤小鼠脾T細(xì)胞亞群取各組小鼠脾臟制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml。每份樣品用抗-CD4-FITC單克隆抗體和抗-CD69-PE單克隆抗體進(jìn)行雙色染色分析，另設(shè)陰性對(duì)照管。流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
　　 14、ELISA檢測(cè)荷瘤小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ水平采用ELISA法對(duì)上述各組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ的含

15、量進(jìn)行檢測(cè)，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處OD值，應(yīng)用SoftMax Pro4.3.1 LS軟件分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)品曲線，計(jì)算樣品中IFN-γ的含量。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)化從轉(zhuǎn)化后的E.coli DH5α中提取pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重組質(zhì)粒，酶切電泳鑒定質(zhì)粒中存在Ag85A基因片段，經(jīng)測(cè)序與GenBank中序列完全一致。
　　 2、RT-PCR法檢測(cè)瞬時(shí)及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染DC中Ag8

16、5A mRNA表達(dá)結(jié)果顯示瞬時(shí)及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/myc-hisA-Ag85A重組質(zhì)粒的DC2.4，均有Ag85A的mRNA表達(dá)。
　　 3、轉(zhuǎn)染DC刺激小鼠T淋巴細(xì)胞增殖DC-Ag85A刺激T細(xì)胞增殖的能力隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增強(qiáng)，72h達(dá)高峰，96h開(kāi)始下降。DC-Ag85A在48h和72h時(shí)的刺激指數(shù)(SI值)分別為10.61±1.06和16.80±2.23，均顯著高于DC-pcDNA(5.90±0.80和7.56±

17、0.57)和DC2.4(7.40±0.88和10.75±0.68)對(duì)照組，差異顯著。
　　 4、轉(zhuǎn)染DC膜表面分子的變化結(jié)果顯示，DC-Ag85A膜表面CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子的表達(dá)率分別為54.05±2.46%、65.29±2.03%和47.83±1.78%，均高于DC-pcDNA(27.87±1.51%、49.43±1.23%和14.49±0.91%)和DC2.4對(duì)照組(27.01±0.69%，39.43±3.42

18、%和15.39±1.28%)，差異顯著。
　　 5、DC疫苗刺激的脾T細(xì)胞對(duì)MB49細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)DC-Ag85A疫苗刺激的脾T細(xì)胞對(duì)MB49的細(xì)胞毒效應(yīng)(73.88±4.64%)高于DC-pcDNA疫苗和DC2.4疫苗組(51.25±6.75%和54.50±5.31%)，也高于未負(fù)載腫瘤抗原的DC2.4(47.03±3.83%)及單純T細(xì)胞對(duì)照組(41.73±7.44%)，差異顯著。
　　 6、DC疫苗刺激的脾T細(xì)胞

19、鄉(xiāng)泌IFN-γ的水平結(jié)果顯示，DC-Ag85A疫苗刺激的脾T細(xì)胞分泌IFN-γ水平(270.05±33.56pg/ml)顯著高于DC-pcDNA疫苗(93.69±6.30pg/ml)和DC2.4疫苗組(102.14±16.95pg/ml)，也顯著高于未負(fù)載腫瘤抗原的DC2.4(5.72±0.99 pg/ml)及單純脾T細(xì)胞對(duì)照組(6.31±1.64 pg/ml)，差異顯著。
　　 7、荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)情況與PBS對(duì)照組相比，DC-

20、Ag85A疫苗組腫瘤形成潛伏期延長(zhǎng)(13.33±2.875d)，腫瘤體積(2.32±0.92cm3)和腫瘤重量(2.16±0.91g)明顯降低。DC-Ag85A疫苗組、DC-pcDNA疫苗組和DC2.4疫苗組對(duì)腫瘤體積和腫瘤重量的抑瘤率分別為51.76%和54.43%、23.28%和28.48%、25.36%和26.79%。
　　 8、腫瘤組織病理學(xué)觀察DC-Ag85A疫苗組有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其它疫苗組和PBS組均僅見(jiàn)少量炎性

21、細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 9、腫瘤組織中浸潤(rùn)T細(xì)胞亞群結(jié)果顯示，DC-Ag85A疫苗組浸潤(rùn)C(jī)D4+和CD8+T細(xì)胞亞群(23.96±4.18個(gè)/HP和28.07±4.74個(gè)/HP)顯著高于PBS對(duì)照組(3.39±1.23個(gè)/HP和6.22±3.36個(gè)/HP)；也高于DC-pcDNA疫苗組(17.66±2.23個(gè)/HP和14.27±3.11個(gè)/HP)和DC2.4疫苗組(15.45±2.34個(gè)/HP和12.56±3.15個(gè)/HP)。

22、　　 10、荷瘤鼠脾T細(xì)胞亞群的變化DC-Ag85A疫苗組小鼠脾臟CD4+T和CD4+CD69+T細(xì)胞數(shù)量分別為22.77±3.95%和8.24±1.42%顯著高于PBS對(duì)照組(17.42±4.27%和3.97±0.79%)。DC-Ag85A疫苗組CD4+CD69+T細(xì)胞數(shù)量(8.24±1.42%)顯著高于DC-pcDNA疫苗(3.71±0.95%)、DC2.4疫苗組(3.98±0.91%)和PBS對(duì)照組(3.97±0.79%)。

23、r>　　 11、荷瘤鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ水平DC-Ag85A疫苗組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平(430.59±53.41 pg/ml)顯著高于DC-pcDNA(110.89±16.58 pg/ml)、DC2.4疫苗組(119.95±30.84 pg/ml)和PBS對(duì)照組(5.49±0.63 pg/ml)。
　　 結(jié)論：
　　 1、重組質(zhì)粒pc-DNA3.1/myc-his-Ag85A成功轉(zhuǎn)染DC2.4，建立了有

24、Ag85AmRNA穩(wěn)定表達(dá)的DC細(xì)胞株。
　　 2、Ag85A基因轉(zhuǎn)染可增強(qiáng)DC2.4膜表面分子MHC-Ⅱ、CD80和CD86的表達(dá)，促進(jìn)DC2.4的成熟及其對(duì)刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力。提示轉(zhuǎn)染Ag85A基因可能會(huì)提高DC的抗原提呈能力。
　　 3、負(fù)載膀胱腫瘤抗原的Ag85A基因修飾的DC疫苗，可體外刺激效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒作用增強(qiáng)和IFN-γ的分泌水平升高，提示該疫苗具有增強(qiáng)抗膀胱腫瘤效應(yīng)。