大豆GmLACS1和GmLACS2基因的克隆與功能初步分析.pdf

1、大豆作為除小麥、水稻、大麥、玉米外的第五大作物,是一種糧油兼用的作物,具有高蛋白、高油的特征。研究大豆的油脂代謝對(duì)于提高大豆的油脂含量很重要。本文主要是鑒定并克隆油脂合成途徑中的長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶,研究其在大豆油脂代謝中的作用。長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶(LACSs)主要是把游離脂肪酸活化成為長(zhǎng)鏈?；o酶A,參與了若干種與脂肪酸相關(guān)的代謝,如脂肪酸鏈的活化、延伸,磷脂、甘油三酯、茉莉酸的生物合成等,從而在生物脂肪酸的合成代謝和分解代謝中起著

2、重要的作用。
　　 我們從幼苗期大豆中通過RT-PCR分離出了兩個(gè)長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶基因,命名為GmLACS1和GmLACS2。GmLACS1基因的ORF區(qū)共1989 bp,編碼662個(gè)氨基酸。GmLACS2的ORF區(qū)共2202bp,編碼733個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示這兩個(gè)長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶(GmLACSs)氨基酸序列都具有這類家族的保守域,與其他的LACSs具有高度的相似性,因此初步被認(rèn)為屬于LACS家族。
　　

3、 通過LACS缺陷型酵母YB525互補(bǔ)實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步證明這兩個(gè)GmLACSs都具有LACS活性。底物偏好性分析表明大豆GmLACSs蛋白都偏好長(zhǎng)鏈脂肪酸。在水解蛋白酶缺陷型酵母pep4中異源表達(dá),結(jié)果顯示GmLACS1和GmLACS2能夠影響宿主酵母的脂肪酸含量,并且GmLACS2能夠使酵母油脂和脂肪酸含量降低。為了進(jìn)一步分析大豆GmLACS2的生物學(xué)功能,我們還構(gòu)建了GmLACS2基因的雙元植物表達(dá)載體,載體中利用在35S強(qiáng)啟動(dòng)子,然

4、后通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化大豆發(fā)狀根。目前已經(jīng)得到GmLACS2的發(fā)狀根系。利用索氏抽提和GC-MS初步分析顯示:GmLACS2大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的油脂與對(duì)照相比降低了9.77％,同時(shí)脂肪酸含量相比對(duì)照降低了約30％-50％。
　　 利用熒光定量PCR技術(shù)分別分析了GmLACS2在不同大豆組織中的表達(dá),結(jié)果顯示:GmLACS2在萌發(fā)中的種子中表達(dá)量最高,同時(shí)在幼嫩的組織中有有很高的表達(dá)量,從而進(jìn)一步表明GmLACS2有可能參與了大豆