椪柑CrHSFA2基因的克隆與功能初步分析.pdf

1、熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSF)在植物抗逆反應(yīng)及生長發(fā)育起著重要的調(diào)控作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在椪柑原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)過程中，熱激轉(zhuǎn)錄因子HSFA2基因表達顯著上調(diào)，且在擬南芥等植物原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)中也上調(diào)表達。因此推測該基因可能對原生質(zhì)體再生起到重要的調(diào)控作用。本研究以椪柑愈傷組織等材料，克隆了CrHSFA2基因，分析了基因表達情況，并對該基因功能進行了初步分析。主要結(jié)果如下:
　　1、采用同源克隆法在椪柑中克隆到CrHSFA2基因

2、的全長cDNA。全長2057bp，具有poly(A)尾、起始密碼子、1155bp的開放閱讀框架(ORF)、367bp的5'非編碼區(qū)、535bp的3'非編碼區(qū)，共編碼384個氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為92891.95Da，理論等電點為6.74。該基因與GenBank甜橙CsHSFA2(XM006475830.1)、克萊蒙柚預測基因(XM006450808.1)、甜菜BvHSFA2(XM016071079.1)核苷酸序列相似性分別為98％、9

3、8％、78％。
　　2、利用Real-Time PCR方法，研究CrHSFA2的表達特性。結(jié)果表明:在40℃高溫脅迫下，處理6h時，愈傷組織、根系、莖、葉片表達量均顯著升高，隨著處理時間延長，該基因在葉片與莖的表達表現(xiàn)出“上升-下降”趨勢，而其他組織表達趨勢較為平穩(wěn)。該基因在原生質(zhì)體6天培養(yǎng)過程中的表達水平均顯著高于愈傷組織。
　　3、對影響椪柑愈傷組織轉(zhuǎn)化效率有關(guān)因子進行了初步優(yōu)化。結(jié)果表明:當侵染時間為20min、侵染濃

4、度為OD600值為0.6、共培養(yǎng)溫度為28℃，轉(zhuǎn)化效率最高。潮霉素濃度為40mg/L時可有效抑制逃逸體的產(chǎn)生;而不同濃度頭孢霉素對于抑制愈傷組織生長作用不大。
　　4、將椪柑CrHSFA2基因?qū)胫参镫p元表達載體pSN1301上，構(gòu)建了pSN1301-CrHSFA2超表達載體。以椪柑胚性愈傷組織為外植體，利用農(nóng)桿菌介導法，將導入載體的農(nóng)桿菌EHA105侵染愈傷組織，采用GUS組織化學染色和實時定量PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)化材料進行鑒定，成功