椪柑CrHSFA2基因的克隆與功能初步分析.pdf

1、熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSF)在植物抗逆反應(yīng)及生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的調(diào)控作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在椪柑原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)過(guò)程中，熱激轉(zhuǎn)錄因子HSFA2基因表達(dá)顯著上調(diào)，且在擬南芥等植物原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)中也上調(diào)表達(dá)。因此推測(cè)該基因可能對(duì)原生質(zhì)體再生起到重要的調(diào)控作用。本研究以椪柑愈傷組織等材料，克隆了CrHSFA2基因，分析了基因表達(dá)情況，并對(duì)該基因功能進(jìn)行了初步分析。主要結(jié)果如下:
　　1、采用同源克隆法在椪柑中克隆到CrHSFA2基因

2、的全長(zhǎng)cDNA。全長(zhǎng)2057bp，具有poly(A)尾、起始密碼子、1155bp的開(kāi)放閱讀框架(ORF)、367bp的5'非編碼區(qū)、535bp的3'非編碼區(qū)，共編碼384個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為92891.95Da，理論等電點(diǎn)為6.74。該基因與GenBank甜橙CsHSFA2(XM006475830.1)、克萊蒙柚預(yù)測(cè)基因(XM006450808.1)、甜菜BvHSFA2(XM016071079.1)核苷酸序列相似性分別為98％、9

3、8％、78％。
　　2、利用Real-Time PCR方法，研究CrHSFA2的表達(dá)特性。結(jié)果表明:在40℃高溫脅迫下，處理6h時(shí)，愈傷組織、根系、莖、葉片表達(dá)量均顯著升高，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，該基因在葉片與莖的表達(dá)表現(xiàn)出“上升-下降”趨勢(shì)，而其他組織表達(dá)趨勢(shì)較為平穩(wěn)。該基因在原生質(zhì)體6天培養(yǎng)過(guò)程中的表達(dá)水平均顯著高于愈傷組織。
　　3、對(duì)影響椪柑愈傷組織轉(zhuǎn)化效率有關(guān)因子進(jìn)行了初步優(yōu)化。結(jié)果表明:當(dāng)侵染時(shí)間為20min、侵染濃

4、度為OD600值為0.6、共培養(yǎng)溫度為28℃，轉(zhuǎn)化效率最高。潮霉素濃度為40mg/L時(shí)可有效抑制逃逸體的產(chǎn)生;而不同濃度頭孢霉素對(duì)于抑制愈傷組織生長(zhǎng)作用不大。
　　4、將椪柑CrHSFA2基因?qū)胫参镫p元表達(dá)載體pSN1301上，構(gòu)建了pSN1301-CrHSFA2超表達(dá)載體。以椪柑胚性愈傷組織為外植體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將導(dǎo)入載體的農(nóng)桿菌EHA105侵染愈傷組織，采用GUS組織化學(xué)染色和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化材料進(jìn)行鑒定，成功