mTOR在TGF-β2誘導的人晶狀體上皮細胞間葉樣轉化過程中的作用.pdf

1、晶狀體上皮細胞(Lensepithelialcells，LECs)對晶狀體的生長發(fā)育、維持晶狀體的正常生理功能至關重要。LECs生長、增殖、移行、分化和分泌細胞外基質的等方面的異常是多種晶狀體疾病特別是后囊膜混濁(posteriorcapsularopacification，PCO)的基礎[1]。
　　 轉化生長因子（transforminggrowthfactorβ，TGF-β）是上皮細胞向間葉樣細胞轉化(epithelial

2、tomesenchymaltransition，EMT)的關鍵因子[2]，現(xiàn)有研究表明，在TGF-β的幾種亞型中，TGF-β2在房水中含量最高，且能有效誘導人晶狀體上皮細胞(HumanlensepithelialcellsHLECs)發(fā)生EMT[3]，目前已成為研究PCO時細胞模型的常用建造工具。
　　 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，

3、在調節(jié)細胞周期進程和細胞生長增殖過程中發(fā)揮中心樞紐的作用[5]。此外，mTOR能夠促進細胞的黏附與移行，參與調節(jié)上皮細胞向間葉樣細胞轉化[6]，但是，mTOR是否在LECs中存在表達，以及mTOR在HLECs向間葉樣轉分化過程中的活化水平及其是否參與調節(jié)HLECs間葉樣轉化至今尚未見報道。
　　 目的：
　　 明確mTOR在TGF-β2誘導的HLECs向間葉樣細胞轉化過程中的活化情況(磷酸化水平S2448-P，S2481

4、-P)及作用。
　　 方法：
　　 1、建立TGF-β2誘導HLECs的EMT體外培養(yǎng)體系
　　 培養(yǎng)的HLECs-B3細胞換用無血清DMEM培養(yǎng)基后，加入TGF-β2，使其終濃度為10ng/ml，分別培養(yǎng)0h、1h、6h、12h、24h、48h，倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化，westernblot法檢測HLECs上皮細胞標志物縫隙連接蛋白43(connexin43，Cx43)、上皮性鈣黏附蛋白(E-cad

5、herin，E-cad)和間葉樣細胞標志物纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA)的表達水平。
　　 2、westernblot法檢測mTOR及其磷酸化水平（S2448-P，S2481-P）在TGF-β2誘導的HLECs的EMT過程中的動態(tài)表達變化。
　　 3、觀察mTOR在TGF-β2誘導HLECs的EMT過程中的活化水平及其作用
　　

6、 3.1、確定mTOR抑制劑雷帕霉素和KU-0063794的最佳作用濃度。
　　 將濃度梯度為0nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1000nM的mTOR抑制劑雷帕霉素和KU-0063794分別加入HLECs-B3細胞，培養(yǎng)24h后，倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化，westernblot法檢測mTOR及其磷酸化水平(S2448-P，S2481-P)。根據(jù)二者對mTOR磷酸化水平的抑制情況以及細胞的生長狀態(tài)，選

7、擇下一步實驗中雷帕霉素和KU-0063794的作用濃度。
　　 3.2、觀察mTOR在TGF-β2誘導HLECs的EMT過程中的活化水平以及mTOR抑制劑對TGF-β2誘導HLECs向間葉樣細胞轉化的影響。
　　 3.2.1、將實驗分為以下組:
　　 對照組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細胞系，生長至80％融合后，換用無血清DMEM培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24h。
　　 TGF-β2組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細

8、胞系，生長至80％融合后，換用無血清DMEM培養(yǎng)基后，終濃度為10ng/mlTGF-β2處理24h。
　　 雷帕霉素組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細胞系，生長至80％融合后換用無血清DMEM培養(yǎng)基，最佳濃度的雷帕霉素（最佳濃度由上述實驗3得到）處理24h。
　　 KU-0063794組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細胞系，生長至80％融合后換用無血清DMEM培養(yǎng)基，最佳濃度的KU-0063794(最佳濃度由上述實驗3得到)

9、處理24h。
　　 雷帕霉素+TGF-β2組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細胞系，生長至80％融合后換用無血清DMEM培養(yǎng)基，最佳濃度的雷帕霉素預處理1h后，10ng/mlTGF-β2處理24h。
　　 KU-0063794+TGF-β2組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細胞系，生長至80％融合后換用無血清DMEM培養(yǎng)基，最佳濃度的KU-0063794預處理1h后，10ng/mlTGF-β2處理24h。
　　 TGF-

10、β2+雷帕霉素組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細胞系，生長至80％融合后換用無血清DMEM培養(yǎng)基，終濃度為10ng/mlTGF-β2處理24h誘導HLECs，待HLECs間葉樣轉化后，再加入最佳濃度的雷帕霉素處理24h。
　　 TGF-β2+KU-0063794組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細胞系，生長至80％融合后換用無血清DMEM培養(yǎng)基，10ng/mlTGF-β2處理24h誘導HLECs，待HLECs間葉樣轉化后，再加入最佳濃

11、度的KU-0063794處理24h。
　　 3.2.2、westernblot法檢測mTOR的表達及其磷酸化水平(S2448-P，S2481-P)。
　　 3.2.3、westernblot法檢測各組上皮細胞標志蛋白E-cad、Cx43，和間葉樣細胞標志FN、α-SMA的表達水平。
　　 4、所有實驗數(shù)據(jù)以(-x)±s表示，利用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。本摘要“方法”部分“1”，“2”，“3.1”項中所

12、述的westernblot實驗均采用One-wayANOVA分析，實驗組與對照組的兩兩比較采用Dunnettt法。本摘要“方法”部分“3.2.2”和“3.2.3””項中所述的westernblot實驗采用One-wayANOVA分析，LSD法進行組間兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1、在10ng/mlTGF-β2誘導HLECs間葉樣轉化過程中，隨著培養(yǎng)時間的增加，HLECs從類橢圓形、多角

13、形逐漸變?yōu)殚L梭形，且細胞間隙增大。與未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs相比，E-cad和Cx43分別于培養(yǎng)的第6h和12h時表達開始下降(E-cad:1.059±0.004,P=0.000;Cx43:0.477±0.076,P=0.032),FN和α-SMA于24h時表達開始增高(FN:0.872±0.134，P=0.011;α-SMA:0.516±0.049，P=0.000)。
　　 2、在10ng/mlTGF-β2誘導HLEC

14、s間葉樣轉化過程中，mTOR在2448和2481位點的磷酸化水平從培養(yǎng)的6h開始增高(S2448-P:0.542±0.124，P=0.006，S2481-P:0.519±0.122，P=0.006)，并呈時間依賴性的磷酸化程度上調，在24h時達到最高水平，但mTOR總表達量沒有變化。
　　 3、mTOR抑制劑可阻斷TGF-β2誘導HLECs的向間葉樣細胞轉化
　　 3.1、倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，使用雷帕霉素或KU-006

15、3794處理HLECs，隨著雷帕霉素和KU-0063794的濃度增高，貼壁HLECs數(shù)量減少，漂浮細胞增多，濃度為300nM的KU-0063794處理HLECs24h后，細胞密度稀疏，濃度為1000nM的KU-0063794處理HLECs24h后，細胞接近全部漂浮死亡。Westernblot顯示10nM的雷帕霉素和KU-0063794均能抑制mTOR(S2448-P，S2481-P)的磷酸化水平，且成一定的濃度依賴性，但各濃度的雷帕霉素

16、和KU-0063794均不影響mTOR的總表達量。結合形態(tài)學，當KU-0063794濃度高于100nM時，貼壁HLECs稀疏，難以進行后續(xù)的實驗處理，故選擇100nM雷帕霉素和KU-0063794進行下一步實驗。
　　 3.2、mTOR抑制劑可阻斷TGF-β2誘導的HLECs向間葉樣細胞轉化
　　 3.2.1、mTOR抑制劑雷帕霉素和KU-0063794均能有效抑制TGF-β2誘導的HLECs內mTOR磷酸化激活

17、　　 與對照組相比，“TGF-β2組”的HLECs內mTOR被磷酸化激活(S2448-P為0.884±0.015，P=0.000;S2481-P為0.874±0.115，P=0.000)，而“雷帕霉素+TGF-β2組”和“KU-0063794+TGF-β2組”中，TGF-β2引起的HLECs內mTOR磷酸化激活被抑制，（“雷帕霉素+TGF-β2組”與“TGF-β2組”相比mTORS2448-P及S2481-P:P=0.000;“KU-

18、0063794+TGF-β2組”與“TGF-β2組”相比mTORS2448-P及S2481-P:P=0.000）。與“TGF-β2組”相比，“TGF-β2+雷帕霉素組”和“TGF-β2+KU-0063794組”中已完成EMT的HLECs中mTOR磷酸化仍被抑制（“TGF-β2+雷帕霉素組”與“TGF-β2組”相比，mTORS2448-P及S2481-P:P=0.000;“TGF-β2+KU-0063794組”與“TGF-β2組”相比mT

19、ORS2448-P及S2481-P:P=0.000）。但是，“TGF-β2+雷帕霉素組”的mTOR磷酸化水平高于“雷帕霉素+TGF-β2組”，“TGF-β2+KU-0063794組”的mTOR磷酸化水平高于“KU-0063794+TGF-β2組”(TGF-β2+雷帕霉素組與雷帕霉素+TGF-β2組相比，mTORS2448-P及S2481-P:P=0.000;TGF-β2+KU-0063794組與KU-0063794+TGF-β2組相比，

20、mTORS2448-P及S2481-P:P=0.000）。KU-0063794對TGF-β2誘導HLECs中mTOR磷酸化的抑制效果強于雷帕霉素(“KU-0063794+TGF-β2組”與“雷帕霉素+TGF-β2組”相比以及“TGF-β2+KU-0063794組”與“雷帕霉素+TGF-β2組”相比mTORS2448-P、S2481-P:P=0.000）。
　　 3.2.2、雷帕霉素和KU-0063794均能有效抑制TGF-β2誘

21、導的HLECs內上皮細胞標志物Cx43、E-cad的表達下降以及間葉樣細胞標志物FN、α-SMA的表達升高。
　　 “對照組”HLECs中表達豐富的E-cad、Cx43以及微量的FN和α-SMA、“雷帕霉素組”或“KU-0063794組”中上皮/間葉樣標志蛋白的表達水平與“對照組”無差別（“雷帕霉素組”與“對照組”相比，E-cadP=0.863，Cx43P=0.807，F(xiàn)NP=0.859、α-SMAP=0.782;“KU-006

22、3794組”與“對照組”相比，E-cadP=0.773，Cx43P=0.834，F(xiàn)NP=0.395、α-SMAP=0.245)?！癟GF-β2組”中E-cad、Cx43表達較“對照組”下降，而FN、α-SMA的表達升高(“TGF-β2組”與“對照組”相比，4種標志蛋白P=0.000)。“雷帕霉素+TGF-β2組”與“TGF-β2組”相比，E-cad、Cx43表達增多，F(xiàn)N、α-SMA表達減少(4種標志蛋白均為P=0.000);“KU-0

23、063794+TGF-β2組”與“TGF-β2組”相比，E-cad、Cx43表達增多，F(xiàn)N以及α-SMA表達減少（4種標志蛋白均為P=0.000）。與“TGF-β2組”相比，“TGF-β2+雷帕霉素組”和“TGF-β2+KU-0063794組”中E-cad、Cx43表達量升高、FN以及α-SMA表達下降（與“TGF-β2組”相比，“TGF-β2+雷帕霉素組”和“TGF-β2+KU-0063794組”中4種標志蛋白均為P=0.000）?！?/p>

24、TGF-β2+雷帕霉素組”中E-cad、Cx43的表達量少于“對照組”，F(xiàn)N以及α-SMA表達量高于“對照組”(4種標志蛋白均為均為P=0.000)?！癟GF-β2+KU-0063794組”中FN表達量與“對照組”相當(FNP=0.071)，但E-cad及Cx43表達量低于“對照組”，α-SMA表達量高于“對照組”(E-cadP=0.017、Cx43P=0.001以及α-SMAP=0.000)。“TGF-β2+雷帕霉素組”與“雷帕霉素+

25、TGF-β2組”相比，E-cad與Cx43的表達量少，而FN及α-SMA的表達量多(4種標志蛋白均為P=0.000)?！癟GF-β2+KU-0063794組”與“KU-0063794+TGF-β2組”相比，E-cad表達量無統(tǒng)計學差異(P=0.063)，但Cx43的表達量減少(P=0.003)，F(xiàn)N和α-SMA的表達量增多(P=0.000)?！癒U-0063794+TGF-β2組”與“雷帕霉素+TGF-β2組”相比，E-cad及Cx43

26、的表達量增多，而FN與α-SMA的表達量減少(E-cadP=0.006，Cx43P=0.012，F(xiàn)N與α-SMA均為P=0.000)，“TGF-β2+KU-0063794組”中E-cad和Cx43的表達也高于“TGF-β2+雷帕霉素組”，F(xiàn)N及α-SMA表達量也低于“TGF-β2+雷帕霉素組”，(E-cad，F(xiàn)N及α-SMA均為P=0.000、Cx43P=0.014)。
　　 結論：
　　 1、10ng/ml的TGF-β

27、2能有效誘導HLECs間葉樣轉化
　　 2、10ng/ml的TGF-β2誘導HLECs間葉樣轉化過程中，HLECs內mTOR磷酸化激活，但mTOR總量未受影響。
　　 3、10nM的雷帕霉素和KU-0063794均能有效抑制mTOR(S2448-P,S2481-P)的磷酸化水平，且成濃度依賴性，但均不影響mTOR總表達量。
　　 4、100nM的雷帕霉素和KU-0063794預處理HLECs均能有效抑制TGF-β

28、2誘導的HLECs內mTOR磷酸化激活以及TGF-β2誘導的HLECs間葉樣轉化。100nM的雷帕霉素和KU-0063794能部分逆轉TGF-β2誘導的HLECs間葉樣轉化，但使用100nM雷帕霉素或KU-0063794預處理再用TGF-β2誘導的HLECs比先用TGF-β2誘導再使用雷帕霉素或KU-0063794的細胞更能維持上皮細胞特性。KU-0063794抑制或者是逆轉TGF-β2誘導的HLECs內mTOR(S2448-P,S24