TGF-β2通過PI3K-Akt信號通路誘導(dǎo)人晶狀體上皮細胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化.pdf

1、后發(fā)性白內(nèi)障是白內(nèi)障術(shù)后最常見的并發(fā)癥，盡管手術(shù)技術(shù)的進步和人工晶狀體材料及其設(shè)計的發(fā)展已經(jīng)降低了后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生率，它仍是白內(nèi)障術(shù)后視力下降的主要原因。目前認為后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)病機制是手術(shù)殘留的晶體上皮細胞異常的增殖、纖維化、移行并伴隨細胞外基質(zhì)的分泌。上皮細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是指上皮細胞獲得間質(zhì)細胞的特征，是后發(fā)性白內(nèi)障發(fā)生的細胞學(xué)基礎(chǔ)，通過該轉(zhuǎn)化，晶狀體

2、上皮細胞間連接消失，細胞遷移能力增強。
　　 轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一種多功能蛋白質(zhì)，屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族蛋白的成員，具有調(diào)節(jié)多種細胞的生長，分化、凋亡和免疫等多項功能。轉(zhuǎn)化生長因子-β是晶狀體在各種生理和病理狀態(tài)下重要的調(diào)節(jié)因子，能夠干擾正常的晶狀體結(jié)構(gòu)，并能夠誘導(dǎo)晶狀體上皮細胞發(fā)生異常的增殖、分化和凋亡，與囊膜下型白內(nèi)障以及后發(fā)性白內(nèi)障的形成有著密切的

3、關(guān)系[1-3]。轉(zhuǎn)化生長因子-β包括三種TGF-β同源異構(gòu)體，轉(zhuǎn)化生長因子-β1，轉(zhuǎn)化生長因子-β2和轉(zhuǎn)化生長因子-β3，其中轉(zhuǎn)化生長因子-β2在眼內(nèi)房水及玻璃體內(nèi)的含量及活性最高，是參與調(diào)節(jié)晶狀體上皮細胞最強的細胞因子之一。
　　 TGF-β2可以誘導(dǎo)晶狀體上皮細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使晶狀體上皮細胞喪失上皮細胞的極性，獲得較強的遷移、侵襲和抗凋亡的能力等間質(zhì)特性，從而具有類肌纖維母細胞樣的特征。目前TGF-β2誘導(dǎo)晶狀體上皮

4、細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化細胞模型已成為白內(nèi)障（包括前囊膜下和后囊膜混濁）形成的細胞模型而被廣泛研究。
　　 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)蛋白激酶家族，廣泛的存在于哺乳動物的細胞漿中。mTOR信號通路與多種細胞的生長、增殖、分化、遷移、自我更新和細胞周期等密切相關(guān)，被認為是一個調(diào)節(jié)細胞周期進程和細胞生長增殖的信號匯聚點。mTOR可接受生長因子、營養(yǎng)（氨基酸）和能量等多種信

5、號，通過包括PI3K/Akt信號通路在內(nèi)的多條信號通路來發(fā)揮作用。
　　 目的:
　　 研究PI3K/Akt信號通路在TGF-β2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的作用及其機制，以期為后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)病機制提供確切的理論依據(jù)，為后發(fā)性白內(nèi)障及此類疾病的藥物干預(yù)提供新的靶點和新的思路及方法。
　　 方法:
　　 1建立TGF-β2誘導(dǎo)HLECs（human lens epithelial cells

6、）間葉樣轉(zhuǎn)化的體外培養(yǎng)體系
　　 常規(guī)培養(yǎng)HLECs-B3細胞系，待其長至80％融合時，去除培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，加入不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基。加入TGF-β2，使其終濃度為10ng/ml，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
　　 共聚焦細胞免疫熒光和western blotting法檢測HLECs-B3細胞的上皮細胞標(biāo)志蛋白——縫隙連接蛋白43（connexin43，Cx43）和間質(zhì)細胞標(biāo)志蛋白——纖維連接蛋白(fib

7、ronectin，F(xiàn)N)的表達變化。
　　 2檢測PI3K/Akt信號通路主要信號分子在TGF-β2誘導(dǎo)HLECs發(fā)生EMT過程中的表達變化
　　 western blotting法檢測PI3K/Akt信號通路主要信號分子，PI3K、Akt和mTOR的表達情況及其磷酸化水平變化。共聚焦細胞免疫熒光法檢測各組細胞p-Akt在細胞內(nèi)的定位。
　　 3 CCK-8實驗檢測PI3K抑制劑LY294002對HLECs細胞增

8、殖的影響
　　 在96孔板中培養(yǎng)HLEC-B3細胞，向培養(yǎng)板加入LY294002，使其終濃度分別為0μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM和80μM，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，向每孔加入10μμL CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于1h、2h、3h上酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度(A)值，計算增殖抑制率。
　　 4觀察PI3K抑制劑LY294002對TGF-β2誘導(dǎo)HLECs細胞上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化的影響。<

9、br>　　 4.1將細胞進行以下分組:
　　 對照組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細胞系，生長至80％融合后，換用無血清DMEM培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24h。
　　 TGF-β2組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細胞系，生長至80％融合后，換用無血清DMEM培養(yǎng)基，加入終濃度為10ng/ml TGF-β2繼續(xù)培養(yǎng)24h。
　　 LY294002+TGF-β2組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細胞系，生長至80％融合后，換用無血

10、清DMEM培養(yǎng)基，20μMLY294002預(yù)處理1h后，10ng/ml TGF-β2繼續(xù)培養(yǎng)24h。
　　 4.2檢測PI3K抑制劑LY294002在TGF-β2誘導(dǎo)HLECs發(fā)生EMT過程中對PI3K/Akt信號通路重要信號分子表達的影響
　　 western blotting法檢測各組細胞PI3K、Akt、mTOR的表達情況及其磷酸化水平。共聚焦細胞免疫熒光法檢測各組細胞p-Akt在細胞內(nèi)的定位。
　　 4.

11、3檢測PI3K抑制劑LY294002對TGF-β2誘導(dǎo)HLECs發(fā)生EMT的影響。
　　 共聚焦細胞免疫熒光法和western blotting法檢測各組細胞的上皮細胞標(biāo)志蛋白Cx43和間葉樣細胞標(biāo)志蛋白FN的表達情況。
　　 5利用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有實驗數(shù)據(jù)以(x)±s表示，CCK-8實驗在3個時間點檢測的不同濃度LY294002對HLE-B3的A值的比較采用重復(fù)測量的方差分析。Western b

12、lot法檢測各蛋白表達量三組間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.TGF-β2誘導(dǎo)HLECs間葉樣轉(zhuǎn)化的體外培養(yǎng)體系的構(gòu)建
　　 1.1共聚焦細胞免疫熒光檢測TGF-β2對HLECs上皮細胞標(biāo)志物Cx43和間葉樣細胞標(biāo)志物FN表達的影響。
　　 為驗證10ng/ml的TGF-β2確實誘導(dǎo)HLECs發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化，我們用共聚焦細胞免

13、疫熒光法檢測上皮細胞標(biāo)志物Cx43和間葉樣細胞標(biāo)志物FN的表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細胞（對照組）表達豐富的Cx43以及微量的FN;而經(jīng)TGF-β2處理24小時組，與對照組相比，Cx43表達下降，F(xiàn)N表達增高，其具體定量檢測見Western blot檢測。
　　 1.2 Western blot檢測TGF-β2對HLECs上皮細胞標(biāo)志物Cx43和間葉樣細胞標(biāo)志物FN表達的影響。
　　 為了

14、進一步驗證10ng/ml的TGF-β2確實誘導(dǎo)HLECs發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化，我們用Western blot法定量檢測上皮細胞標(biāo)志物Cx43和間葉樣細胞標(biāo)志物FN的表達變化，蛋白表達量以“目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值”表示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細胞（對照組）表達豐富的Cx43(2.53±0.14)，而經(jīng)TGF-β2處理24小時組，與對照組相比，Cx43表達量(1.40±0.10)下降，兩組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意

15、義(P＜0.05)。未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細胞（對照組）表達微量的FN(0.29±0.02)，而經(jīng)TGF-β2處理24小時組，與對照組相比，F(xiàn)N表達量(0.97±0.09)明顯增高，兩組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.PI3K/Akt信號通路主要信號分子在TGF-β2誘導(dǎo)HLECs上皮-間葉樣轉(zhuǎn)化過程中的表達變化
　　 2.1共聚焦細胞免疫熒光檢測TGF-β2對PI3K/Akt信號通

16、路主要信號分子p-Akt表達的影響。
　　 為驗證TGF-β2確實通過PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)HLECs發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化，我們采用共聚焦細胞免疫熒光法檢測TGF-β2誘導(dǎo)HLECs發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化過程中，PI3K/Akt信號通路主要信號分子p-Akt在細胞內(nèi)定位及表達量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細胞（對照組）表達微量的p-Akt，熒光顯微鏡下無明顯細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)顯現(xiàn);而經(jīng)TGF-β2處理24小時組，與

17、對照組相比，p-Akt表達量明顯增高，并向細胞膜聚集，使得細胞膜輪廓鮮明，在一部分細胞甚至能夠清晰辨別細胞的形態(tài)，其具體的定量檢測見Western blot檢測。
　　 2.2 Western blot檢測TGF-β2對PI3K/Akt信號通路主要信號分子表達的影響。
　　 為了進一步驗證TGF-β2確實通過PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)HLECs發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化，我們用Western blot法定量檢測TGF-β2誘導(dǎo)HL

18、ECs發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化過程中，PI3K/Akt信號通路主要信號分子的表達變化，蛋白表達量以“目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值”表示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細胞（對照組）表達微量的p-PI3K(0.69±0.01)，而經(jīng)TGF-β2處理24小時組，與對照組相比，p-PI3K表達量(0.92±0.11)增高，兩組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細胞（對照組）表達微量的p

19、-Akt(0.91±0.08)，而經(jīng)TGF-β2處理24小時組，與對照組相比，p-Akt表達量(1.48±0.13)增高，兩組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs細胞（對照組）表達微量的p-mTOR(0.64±0.02)，而經(jīng)TGF-β2處理24小時組，與對照組相比，p-mTOR表達量(1.22±0.12)增高，兩組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.CCK-8實驗檢測PI

20、3K抑制劑LY294002對HLEC-B3細胞增殖的影響
　　 CCK-8實驗檢測不同濃度（0μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM和80μM）LY294002對HLE-B3細胞增殖的影響，于1小時、2小時、3小時上酶標(biāo)儀讀取各孔吸光度(A)值，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示:隨著LY294002濃度的增加A值逐漸減小，即對HLE-B3細胞增殖抑制逐漸增強，A值在不同濃度組有顯著差異(F=9.72，P=0.

21、000);不同時間點測得的A值也存在顯著差異(F=1737.54，P=0.000);濃度分組和測量時間點相互之間存在顯著地交互作用(F=5.60，P=0.000)。
　　 4.PI3K抑制劑LY294002對TGF-β2誘導(dǎo)HLECs上皮-間葉樣轉(zhuǎn)化過程中PI3K/Akt信號通路信號分子表達變化的影響
　　 4.1共聚焦細胞免疫熒光檢測PI3K抑制劑LY294002對TGF-β2誘導(dǎo)HLECs上皮-間葉樣轉(zhuǎn)化過程中PI3

22、K/Akt信號通路信號分子p-Akt表達的影響。
　　 為驗證在TGF-β2誘導(dǎo)HLECs發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化過程中，Akt被磷酸化激活，我們用共聚焦細胞免疫熒光法檢測在TGF-β2誘導(dǎo)HLECs發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化過程中，PI3K/Akt信號通路主要信號分子p-Akt在細胞內(nèi)定位及表達量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細胞（對照組）表達微量的p-Akt，熒光顯微鏡下無明顯細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)顯現(xiàn);而經(jīng)TGF-β2處理24小

23、時組，與對照組相比，p-Akt表達明顯增高，并向細胞膜聚集，使得細胞膜輪廓鮮明，在一部分細胞甚至能夠清晰辨別細胞的形態(tài)。而經(jīng)LY294002預(yù)處理1小時后再加入TGF-β2繼續(xù)處理24小時組，與TGF-β2組相比，p-Akt表達明顯降低，熒光顯微鏡下亦未觀察到明顯的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。其具體的定量檢測見Western blot檢測。
　　 4.2Western blot檢測PI3K抑制劑LY294002對TGF-β2誘導(dǎo)HLECs上皮

24、-間葉樣轉(zhuǎn)化過程中PI3K/Akt信號通路主要信號分子表達的影響。
　　 為了檢測PI3K抑制劑LY294002是否能夠阻斷TGF-β2誘導(dǎo)HLECs發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化過程中PI3K/Akt信號通路的激活，我們用Western blot法定量檢測PI3K/Akt信號通路主要信號分子的表達變化，蛋白表達量以“目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值”表示。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細胞（對照組）表達微量的

25、p-PI3K(0.69±0.01)，而經(jīng)TGF-β2處理24小時，與對照組相比，p-PI3K表達量(0.92±0.11)增高，而經(jīng)LY294002預(yù)處理1小時后再加入TGF-β2繼續(xù)處理24小時組，與TGF-β2組相比，p-PI3K表達量(0.48±0.03)降低。三組間p-PI3K表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=35.50，P=0.000);TGF-β2組與對照組兩組間p-PI3K表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，TGF-β2組

26、與LY294002+TGF-β2組兩組間p-PI3K表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細胞（對照組）表達微量的p-Akt(0.91±0.08)，而經(jīng)TGF-β2處理24小時，與對照組相比，p-Akt表達量(1.48±0.13)增高，而經(jīng)LY294002預(yù)處理1小時后再加入TGF-β2繼續(xù)處理24小時組，與TGF-β2組相比，p-Akt表達量(0.95±0.19)降低

27、。三組間p-Akt表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=15.04，P=0.005);TGF-β2組與對照組兩組間p-Akt表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，TGF-β2組與LY294002+TGF-β2組兩組間p-Akt表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs細胞（對照組）表達微量的p-mTOR(0.64±0.02)，而經(jīng)TGF-β2處理24小時后，與對照組相比，p-mTOR

28、表達量(1.22±0.12)增高，而經(jīng)LY294002預(yù)處理1小時后再加入TGF-β2繼續(xù)處理24小時組，與TGF-β2組相比，p-mTOR表達量(0.76±0.07)降低。三組間p-mTOR表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=39.43，P=0.000);TGF-β2組與對照組兩組間p-mTOR表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，TGF-β2組與LY294002+TGF-β2組兩組間p-mTOR表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)

29、。
　　 5.PI3K抑制劑LY294002可阻斷TGF-β2誘導(dǎo)HLECs細胞間葉樣細胞轉(zhuǎn)化
　　 5.1共聚焦細胞免疫熒光檢測PI3K抑制劑LY294002對TGF-β2誘導(dǎo)HLECs上皮細胞標(biāo)志物Cx43和間葉樣細胞標(biāo)志物FN表達的影響。
　　 為驗證PI3K抑制劑LY294002確實阻斷TGF-β2誘導(dǎo)HLECs發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化，我們用共聚焦細胞免疫熒光法檢測上皮細胞標(biāo)志物Cx43和間葉樣細胞標(biāo)志物FN的表

30、達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細胞（對照組）表達豐富的Cx43以及微量的FN;經(jīng)TGF-β2處理24小時組，與對照組相比，Cx43表達下降，F(xiàn)N表達增高;而經(jīng)LY294002預(yù)處理1小時后再加入TGF-β2繼續(xù)處理24小時組，與TGF-β2組相比，Cx43表達增高，F(xiàn)N表達下降。其具體的定量檢測見Western blot檢測。
　　 5.2 Western blot檢測PI3K抑制劑LY294002對T

31、GF-β2誘導(dǎo)HLECs上皮細胞標(biāo)志物Cx43和間葉樣細胞標(biāo)志物FN表達的影響。
　　 為了進一步驗證PI3K抑制劑LY294002確實阻斷TGF-β2誘導(dǎo)HLECs細胞發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化，我們用Western blot法定量檢測上皮細胞標(biāo)志蛋白Cx43和間葉樣細胞標(biāo)志蛋白FN的表達變化，蛋白表達量以“目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值”表示。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細胞（對照組）表達豐富的Cx

32、43(2.53±0.14)，而經(jīng)TGF-β2處理24小時組，與對照組相比，Cx43表達量(1.40±0.10)下降，而經(jīng)LY294002預(yù)處理1小時后再加入TGF-β2繼續(xù)處理24小時組，與TGF-β2組相比，Cx43表達量(2.35±0.16)增加。三組間Cx43表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=60.02，P=0.000);TGF-β2組與對照組兩組間Cx43表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，TGF-β2組與LY294002+T

33、GF-β2組兩組間Cx43表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)果表明，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細胞（對照組）表達微量的FN(0.29±0.02)，而經(jīng)TGF-β2處理24小時組，與對照組相比，F(xiàn)N表達量(0.97±0.09)增高，而經(jīng)LY294002預(yù)處理1小時后再加入TGF-β2繼續(xù)處理24小時組，與TGF-β2組相比，F(xiàn)N表達量(0.38±0.04)降低。三組間FN表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=

34、117.01，P=0.000);TGF-β2組與對照組兩組間FN表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，TGF-β2組與LY294002+TGF-β2組兩組間FN表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 110 ng/ml的TGF-β2能夠有效誘導(dǎo)人晶狀體上皮細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
　　 2在10 ng/ml的TGF-β2誘導(dǎo)人晶狀體上皮細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中，PI3K/Akt信號通路

35、信號分子PI3K、Akt和mTOR被磷酸化激活。
　　 3隨著LY294002濃度的增加，其對人晶狀體上皮細胞的增殖抑制率逐漸增強。
　　 420μM的LY294002預(yù)處理人晶狀體上皮細胞，能有效抑制TGF-β2誘導(dǎo)的PI3K、Akt和mTOR的磷酸化激活。
　　 520μM的LY294002預(yù)處理人晶狀體上皮細胞，能有效抑制TGF-β2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
　　 以上實驗結(jié)論共同論證了