TGF-β2通過(guò)PI3K-Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化.pdf

1、后發(fā)性白內(nèi)障是白內(nèi)障術(shù)后最常見(jiàn)的并發(fā)癥，盡管手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步和人工晶狀體材料及其設(shè)計(jì)的發(fā)展已經(jīng)降低了后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生率，它仍是白內(nèi)障術(shù)后視力下降的主要原因。目前認(rèn)為后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制是手術(shù)殘留的晶體上皮細(xì)胞異常的增殖、纖維化、移行并伴隨細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。上皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是指上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特征，是后發(fā)性白內(nèi)障發(fā)生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，通過(guò)該轉(zhuǎn)化，晶狀體

2、上皮細(xì)胞間連接消失，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。
　　 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一種多功能蛋白質(zhì)，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族蛋白的成員，具有調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)，分化、凋亡和免疫等多項(xiàng)功能。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β是晶狀體在各種生理和病理狀態(tài)下重要的調(diào)節(jié)因子，能夠干擾正常的晶狀體結(jié)構(gòu)，并能夠誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生異常的增殖、分化和凋亡，與囊膜下型白內(nèi)障以及后發(fā)性白內(nèi)障的形成有著密切的

3、關(guān)系[1-3]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β包括三種TGF-β同源異構(gòu)體，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2在眼內(nèi)房水及玻璃體內(nèi)的含量及活性最高，是參與調(diào)節(jié)晶狀體上皮細(xì)胞最強(qiáng)的細(xì)胞因子之一。
　　 TGF-β2可以誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使晶狀體上皮細(xì)胞喪失上皮細(xì)胞的極性，獲得較強(qiáng)的遷移、侵襲和抗凋亡的能力等間質(zhì)特性，從而具有類(lèi)肌纖維母細(xì)胞樣的特征。目前TGF-β2誘導(dǎo)晶狀體上皮

4、細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型已成為白內(nèi)障（包括前囊膜下和后囊膜混濁）形成的細(xì)胞模型而被廣泛研究。
　　 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)蛋白激酶家族，廣泛的存在于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞漿中。mTOR信號(hào)通路與多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、遷移、自我更新和細(xì)胞周期等密切相關(guān)，被認(rèn)為是一個(gè)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的信號(hào)匯聚點(diǎn)。mTOR可接受生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)（氨基酸）和能量等多種信

5、號(hào)，通過(guò)包括PI3K/Akt信號(hào)通路在內(nèi)的多條信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用。
　　 目的:
　　 研究PI3K/Akt信號(hào)通路在TGF-β2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用及其機(jī)制，以期為后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制提供確切的理論依據(jù)，為后發(fā)性白內(nèi)障及此類(lèi)疾病的藥物干預(yù)提供新的靶點(diǎn)和新的思路及方法。
　　 方法:
　　 1建立TGF-β2誘導(dǎo)HLECs（human lens epithelial cells

6、）間葉樣轉(zhuǎn)化的體外培養(yǎng)體系
　　 常規(guī)培養(yǎng)HLECs-B3細(xì)胞系，待其長(zhǎng)至80％融合時(shí)，去除培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，加入不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基。加入TGF-β2，使其終濃度為10ng/ml，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。
　　 共聚焦細(xì)胞免疫熒光和western blotting法檢測(cè)HLECs-B3細(xì)胞的上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白——縫隙連接蛋白43（connexin43，Cx43）和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白——纖維連接蛋白(fib

7、ronectin，F(xiàn)N)的表達(dá)變化。
　　 2檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路主要信號(hào)分子在TGF-β2誘導(dǎo)HLECs發(fā)生EMT過(guò)程中的表達(dá)變化
　　 western blotting法檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路主要信號(hào)分子，PI3K、Akt和mTOR的表達(dá)情況及其磷酸化水平變化。共聚焦細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞p-Akt在細(xì)胞內(nèi)的定位。
　　 3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PI3K抑制劑LY294002對(duì)HLECs細(xì)胞增

8、殖的影響
　　 在96孔板中培養(yǎng)HLEC-B3細(xì)胞，向培養(yǎng)板加入LY294002，使其終濃度分別為0μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM和80μM，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，向每孔加入10μμL CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于1h、2h、3h上酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度(A)值，計(jì)算增殖抑制率。
　　 4觀察PI3K抑制劑LY294002對(duì)TGF-β2誘導(dǎo)HLECs細(xì)胞上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化的影響。<

9、br>　　 4.1將細(xì)胞進(jìn)行以下分組:
　　 對(duì)照組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細(xì)胞系，生長(zhǎng)至80％融合后，換用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24h。
　　 TGF-β2組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細(xì)胞系，生長(zhǎng)至80％融合后，換用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，加入終濃度為10ng/ml TGF-β2繼續(xù)培養(yǎng)24h。
　　 LY294002+TGF-β2組:常規(guī)培養(yǎng)的HLECs-B3細(xì)胞系，生長(zhǎng)至80％融合后，換用無(wú)血

10、清DMEM培養(yǎng)基，20μMLY294002預(yù)處理1h后，10ng/ml TGF-β2繼續(xù)培養(yǎng)24h。
　　 4.2檢測(cè)PI3K抑制劑LY294002在TGF-β2誘導(dǎo)HLECs發(fā)生EMT過(guò)程中對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路重要信號(hào)分子表達(dá)的影響
　　 western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞PI3K、Akt、mTOR的表達(dá)情況及其磷酸化水平。共聚焦細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞p-Akt在細(xì)胞內(nèi)的定位。
　　 4.

11、3檢測(cè)PI3K抑制劑LY294002對(duì)TGF-β2誘導(dǎo)HLECs發(fā)生EMT的影響。
　　 共聚焦細(xì)胞免疫熒光法和western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞的上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白Cx43和間葉樣細(xì)胞標(biāo)志蛋白FN的表達(dá)情況。
　　 5利用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(x)±s表示，CCK-8實(shí)驗(yàn)在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)的不同濃度LY294002對(duì)HLE-B3的A值的比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析。Western b

12、lot法檢測(cè)各蛋白表達(dá)量三組間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.TGF-β2誘導(dǎo)HLECs間葉樣轉(zhuǎn)化的體外培養(yǎng)體系的構(gòu)建
　　 1.1共聚焦細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)TGF-β2對(duì)HLECs上皮細(xì)胞標(biāo)志物Cx43和間葉樣細(xì)胞標(biāo)志物FN表達(dá)的影響。
　　 為驗(yàn)證10ng/ml的TGF-β2確實(shí)誘導(dǎo)HLECs發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化，我們用共聚焦細(xì)胞免

13、疫熒光法檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志物Cx43和間葉樣細(xì)胞標(biāo)志物FN的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細(xì)胞（對(duì)照組）表達(dá)豐富的Cx43以及微量的FN;而經(jīng)TGF-β2處理24小時(shí)組，與對(duì)照組相比，Cx43表達(dá)下降，F(xiàn)N表達(dá)增高，其具體定量檢測(cè)見(jiàn)Western blot檢測(cè)。
　　 1.2 Western blot檢測(cè)TGF-β2對(duì)HLECs上皮細(xì)胞標(biāo)志物Cx43和間葉樣細(xì)胞標(biāo)志物FN表達(dá)的影響。
　　 為了

14、進(jìn)一步驗(yàn)證10ng/ml的TGF-β2確實(shí)誘導(dǎo)HLECs發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化，我們用Western blot法定量檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志物Cx43和間葉樣細(xì)胞標(biāo)志物FN的表達(dá)變化，蛋白表達(dá)量以“目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值”表示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細(xì)胞（對(duì)照組）表達(dá)豐富的Cx43(2.53±0.14)，而經(jīng)TGF-β2處理24小時(shí)組，與對(duì)照組相比，Cx43表達(dá)量(1.40±0.10)下降，兩組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

15、義(P＜0.05)。未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細(xì)胞（對(duì)照組）表達(dá)微量的FN(0.29±0.02)，而經(jīng)TGF-β2處理24小時(shí)組，與對(duì)照組相比，F(xiàn)N表達(dá)量(0.97±0.09)明顯增高，兩組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.PI3K/Akt信號(hào)通路主要信號(hào)分子在TGF-β2誘導(dǎo)HLECs上皮-間葉樣轉(zhuǎn)化過(guò)程中的表達(dá)變化
　　 2.1共聚焦細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)TGF-β2對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通

16、路主要信號(hào)分子p-Akt表達(dá)的影響。
　　 為驗(yàn)證TGF-β2確實(shí)通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)HLECs發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化，我們采用共聚焦細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)TGF-β2誘導(dǎo)HLECs發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化過(guò)程中，PI3K/Akt信號(hào)通路主要信號(hào)分子p-Akt在細(xì)胞內(nèi)定位及表達(dá)量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細(xì)胞（對(duì)照組）表達(dá)微量的p-Akt，熒光顯微鏡下無(wú)明顯細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)顯現(xiàn);而經(jīng)TGF-β2處理24小時(shí)組，與

17、對(duì)照組相比，p-Akt表達(dá)量明顯增高，并向細(xì)胞膜聚集，使得細(xì)胞膜輪廓鮮明，在一部分細(xì)胞甚至能夠清晰辨別細(xì)胞的形態(tài)，其具體的定量檢測(cè)見(jiàn)Western blot檢測(cè)。
　　 2.2 Western blot檢測(cè)TGF-β2對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路主要信號(hào)分子表達(dá)的影響。
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證TGF-β2確實(shí)通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)HLECs發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化，我們用Western blot法定量檢測(cè)TGF-β2誘導(dǎo)HL

18、ECs發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化過(guò)程中，PI3K/Akt信號(hào)通路主要信號(hào)分子的表達(dá)變化，蛋白表達(dá)量以“目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值”表示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細(xì)胞（對(duì)照組）表達(dá)微量的p-PI3K(0.69±0.01)，而經(jīng)TGF-β2處理24小時(shí)組，與對(duì)照組相比，p-PI3K表達(dá)量(0.92±0.11)增高，兩組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細(xì)胞（對(duì)照組）表達(dá)微量的p

19、-Akt(0.91±0.08)，而經(jīng)TGF-β2處理24小時(shí)組，與對(duì)照組相比，p-Akt表達(dá)量(1.48±0.13)增高，兩組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs細(xì)胞（對(duì)照組）表達(dá)微量的p-mTOR(0.64±0.02)，而經(jīng)TGF-β2處理24小時(shí)組，與對(duì)照組相比，p-mTOR表達(dá)量(1.22±0.12)增高，兩組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PI

20、3K抑制劑LY294002對(duì)HLEC-B3細(xì)胞增殖的影響
　　 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度（0μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM和80μM）LY294002對(duì)HLE-B3細(xì)胞增殖的影響，于1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)上酶標(biāo)儀讀取各孔吸光度(A)值，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示:隨著LY294002濃度的增加A值逐漸減小，即對(duì)HLE-B3細(xì)胞增殖抑制逐漸增強(qiáng)，A值在不同濃度組有顯著差異(F=9.72，P=0.

21、000);不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的A值也存在顯著差異(F=1737.54，P=0.000);濃度分組和測(cè)量時(shí)間點(diǎn)相互之間存在顯著地交互作用(F=5.60，P=0.000)。
　　 4.PI3K抑制劑LY294002對(duì)TGF-β2誘導(dǎo)HLECs上皮-間葉樣轉(zhuǎn)化過(guò)程中PI3K/Akt信號(hào)通路信號(hào)分子表達(dá)變化的影響
　　 4.1共聚焦細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)PI3K抑制劑LY294002對(duì)TGF-β2誘導(dǎo)HLECs上皮-間葉樣轉(zhuǎn)化過(guò)程中PI3

22、K/Akt信號(hào)通路信號(hào)分子p-Akt表達(dá)的影響。
　　 為驗(yàn)證在TGF-β2誘導(dǎo)HLECs發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化過(guò)程中，Akt被磷酸化激活，我們用共聚焦細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)在TGF-β2誘導(dǎo)HLECs發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化過(guò)程中，PI3K/Akt信號(hào)通路主要信號(hào)分子p-Akt在細(xì)胞內(nèi)定位及表達(dá)量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細(xì)胞（對(duì)照組）表達(dá)微量的p-Akt，熒光顯微鏡下無(wú)明顯細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)顯現(xiàn);而經(jīng)TGF-β2處理24小

23、時(shí)組，與對(duì)照組相比，p-Akt表達(dá)明顯增高，并向細(xì)胞膜聚集，使得細(xì)胞膜輪廓鮮明，在一部分細(xì)胞甚至能夠清晰辨別細(xì)胞的形態(tài)。而經(jīng)LY294002預(yù)處理1小時(shí)后再加入TGF-β2繼續(xù)處理24小時(shí)組，與TGF-β2組相比，p-Akt表達(dá)明顯降低，熒光顯微鏡下亦未觀察到明顯的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。其具體的定量檢測(cè)見(jiàn)Western blot檢測(cè)。
　　 4.2Western blot檢測(cè)PI3K抑制劑LY294002對(duì)TGF-β2誘導(dǎo)HLECs上皮

24、-間葉樣轉(zhuǎn)化過(guò)程中PI3K/Akt信號(hào)通路主要信號(hào)分子表達(dá)的影響。
　　 為了檢測(cè)PI3K抑制劑LY294002是否能夠阻斷TGF-β2誘導(dǎo)HLECs發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化過(guò)程中PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，我們用Western blot法定量檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路主要信號(hào)分子的表達(dá)變化，蛋白表達(dá)量以“目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值”表示。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細(xì)胞（對(duì)照組）表達(dá)微量的

25、p-PI3K(0.69±0.01)，而經(jīng)TGF-β2處理24小時(shí)，與對(duì)照組相比，p-PI3K表達(dá)量(0.92±0.11)增高，而經(jīng)LY294002預(yù)處理1小時(shí)后再加入TGF-β2繼續(xù)處理24小時(shí)組，與TGF-β2組相比，p-PI3K表達(dá)量(0.48±0.03)降低。三組間p-PI3K表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.50，P=0.000);TGF-β2組與對(duì)照組兩組間p-PI3K表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，TGF-β2組

26、與LY294002+TGF-β2組兩組間p-PI3K表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細(xì)胞（對(duì)照組）表達(dá)微量的p-Akt(0.91±0.08)，而經(jīng)TGF-β2處理24小時(shí)，與對(duì)照組相比，p-Akt表達(dá)量(1.48±0.13)增高，而經(jīng)LY294002預(yù)處理1小時(shí)后再加入TGF-β2繼續(xù)處理24小時(shí)組，與TGF-β2組相比，p-Akt表達(dá)量(0.95±0.19)降低

27、。三組間p-Akt表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.04，P=0.005);TGF-β2組與對(duì)照組兩組間p-Akt表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，TGF-β2組與LY294002+TGF-β2組兩組間p-Akt表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs細(xì)胞（對(duì)照組）表達(dá)微量的p-mTOR(0.64±0.02)，而經(jīng)TGF-β2處理24小時(shí)后，與對(duì)照組相比，p-mTOR

28、表達(dá)量(1.22±0.12)增高，而經(jīng)LY294002預(yù)處理1小時(shí)后再加入TGF-β2繼續(xù)處理24小時(shí)組，與TGF-β2組相比，p-mTOR表達(dá)量(0.76±0.07)降低。三組間p-mTOR表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=39.43，P=0.000);TGF-β2組與對(duì)照組兩組間p-mTOR表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，TGF-β2組與LY294002+TGF-β2組兩組間p-mTOR表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

29、。
　　 5.PI3K抑制劑LY294002可阻斷TGF-β2誘導(dǎo)HLECs細(xì)胞間葉樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化
　　 5.1共聚焦細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)PI3K抑制劑LY294002對(duì)TGF-β2誘導(dǎo)HLECs上皮細(xì)胞標(biāo)志物Cx43和間葉樣細(xì)胞標(biāo)志物FN表達(dá)的影響。
　　 為驗(yàn)證PI3K抑制劑LY294002確實(shí)阻斷TGF-β2誘導(dǎo)HLECs發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化，我們用共聚焦細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志物Cx43和間葉樣細(xì)胞標(biāo)志物FN的表

30、達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細(xì)胞（對(duì)照組）表達(dá)豐富的Cx43以及微量的FN;經(jīng)TGF-β2處理24小時(shí)組，與對(duì)照組相比，Cx43表達(dá)下降，F(xiàn)N表達(dá)增高;而經(jīng)LY294002預(yù)處理1小時(shí)后再加入TGF-β2繼續(xù)處理24小時(shí)組，與TGF-β2組相比，Cx43表達(dá)增高，F(xiàn)N表達(dá)下降。其具體的定量檢測(cè)見(jiàn)Western blot檢測(cè)。
　　 5.2 Western blot檢測(cè)PI3K抑制劑LY294002對(duì)T

31、GF-β2誘導(dǎo)HLECs上皮細(xì)胞標(biāo)志物Cx43和間葉樣細(xì)胞標(biāo)志物FN表達(dá)的影響。
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證PI3K抑制劑LY294002確實(shí)阻斷TGF-β2誘導(dǎo)HLECs細(xì)胞發(fā)生間葉樣轉(zhuǎn)化，我們用Western blot法定量檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白Cx43和間葉樣細(xì)胞標(biāo)志蛋白FN的表達(dá)變化，蛋白表達(dá)量以“目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值”表示。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細(xì)胞（對(duì)照組）表達(dá)豐富的Cx

32、43(2.53±0.14)，而經(jīng)TGF-β2處理24小時(shí)組，與對(duì)照組相比，Cx43表達(dá)量(1.40±0.10)下降，而經(jīng)LY294002預(yù)處理1小時(shí)后再加入TGF-β2繼續(xù)處理24小時(shí)組，與TGF-β2組相比，Cx43表達(dá)量(2.35±0.16)增加。三組間Cx43表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=60.02，P=0.000);TGF-β2組與對(duì)照組兩組間Cx43表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，TGF-β2組與LY294002+T

33、GF-β2組兩組間Cx43表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)果表明，未經(jīng)TGF-β2處理的HLECs-B3細(xì)胞（對(duì)照組）表達(dá)微量的FN(0.29±0.02)，而經(jīng)TGF-β2處理24小時(shí)組，與對(duì)照組相比，F(xiàn)N表達(dá)量(0.97±0.09)增高，而經(jīng)LY294002預(yù)處理1小時(shí)后再加入TGF-β2繼續(xù)處理24小時(shí)組，與TGF-β2組相比，F(xiàn)N表達(dá)量(0.38±0.04)降低。三組間FN表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=

34、117.01，P=0.000);TGF-β2組與對(duì)照組兩組間FN表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，TGF-β2組與LY294002+TGF-β2組兩組間FN表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 110 ng/ml的TGF-β2能夠有效誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
　　 2在10 ng/ml的TGF-β2誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中，PI3K/Akt信號(hào)通路

35、信號(hào)分子PI3K、Akt和mTOR被磷酸化激活。
　　 3隨著LY294002濃度的增加，其對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞的增殖抑制率逐漸增強(qiáng)。
　　 420μM的LY294002預(yù)處理人晶狀體上皮細(xì)胞，能有效抑制TGF-β2誘導(dǎo)的PI3K、Akt和mTOR的磷酸化激活。
　　 520μM的LY294002預(yù)處理人晶狀體上皮細(xì)胞，能有效抑制TGF-β2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
　　 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)論共同論證了