環(huán)氧合酶-2在TNF-α誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)分化中的作用及其機制研究.pdf

1、目的：
　　后發(fā)性白內(nèi)障（又稱后囊膜渾濁，posterior capsular opacification，PCO）是目前白內(nèi)障術(shù)后最主要的并發(fā)癥，其主要的病理機制是術(shù)后殘留的晶狀體上皮在活化或升高的細(xì)胞因子等作用下發(fā)生細(xì)胞增殖、遷移和上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化等。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是白內(nèi)障術(shù)后房水中存在的一種重要的炎癥因子，被認(rèn)為和PCO的形成有關(guān)。另外有研究表明環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX

2、-2)抑制劑在體內(nèi)實驗和體外模擬實驗中均可以有效地抑制PCO的發(fā)生，但其藥理作用的分子機制仍不明確。
　　因此本學(xué)位論文旨在通過體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞模型，探究TNF-α對COX-2的表達(dá)調(diào)控機制，及COX-2在TNF-α誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)分化中的作用及其可能的機制。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)的人品狀體上皮細(xì)胞（hLEC-B3）分為兩組，即10 ng/ml TNF-α刺激組和無TNF-α刺激的對照組，在

3、刺激后6h、24 h、48 h，用實時定量PCR和 Western Blot檢測COX-2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。同時，經(jīng)TNF-α刺激后24 h，用定量PCR和Western Blot檢測細(xì)胞增殖和EMT的標(biāo)志物細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和波形蛋白(Vimentin)mRNA及蛋白表達(dá)水平，并用Cell Count Kit-8(CCK-8)試劑盒和Transwell遷移小室實驗分別檢測細(xì)胞增殖和遷移能力。在光學(xué)顯微鏡觀

4、察細(xì)胞形態(tài)變化。在TNF-α刺激前加入溴芬酸鈉24 h以阻斷COX-2，然后檢測細(xì)胞增殖和EMT的改變。
　　觀察hLEC-B3細(xì)胞經(jīng)10 ng/ml TNF-α刺激時間梯度效應(yīng)，用Western Blot檢測JNK磷酸化水平的改變以及轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的活化水平，提取細(xì)胞核蛋白的檢測和細(xì)胞免疫熒光的方法來觀察p-c-Jun的入核情況。預(yù)先加入JNK抑制劑SP600125或轉(zhuǎn)染c-Jun siRNA后檢測COX-2表達(dá)的改變，以鑒

5、定JNK信號通路對COX-2表達(dá)的調(diào)控作用，并利用染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）驗證p-c-Jun與COX-2啟動子區(qū)DNA序列的直接相互作用。
　　為進(jìn)一步探索COX-2可能介導(dǎo)的機制，通過Western Blot及雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的方法來研究TNF-α對GSK-3β/β-catenin通路以及β-catenin轉(zhuǎn)錄活性的影響，并通過阻斷COX-2或JNK通路以探究JNK/COX-2在GS K-3β/β-catenin通路活

6、化中的作用。
　　結(jié)果：
　　TNF-α可以誘導(dǎo)hLEC-B3細(xì)胞COX-2的高表達(dá)以及Cyclin D1和Vimentin表達(dá)的升高，并促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和纖維化形態(tài)改變。預(yù)先加入溴芬酸鈉阻斷COX-2可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的Cyclin D1和Vimentin的高表達(dá)及細(xì)胞增殖和EMT。TNF-α通過激活JNK/p-c-Jun信號通路調(diào)控COX-2的表達(dá)，ChIP-qPCR結(jié)果顯示p-c-Jun與COX-2啟動子區(qū)DNA

7、序列具有直接相互作用。另外，TNF-α可以激活GSK-3β/β-catenin通路并提高β-catenin轉(zhuǎn)錄活性。藥物阻斷COX-2或JNK信號通路均可以抑制TNF-α活化的GSK-3β/β-catenin通路和β-catenin轉(zhuǎn)錄活性。轉(zhuǎn)染β-catenin siRNA可減弱了溴芬酸鈉對TNF-α誘導(dǎo)的Cyclin D1和Vimentin高表達(dá)的抑制效應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　TNF-α通過JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控COX-2