轉化生長因子β-,2-誘導人晶狀體上皮細胞凋亡及侵襲過程中的機制研究.pdf

1、白內障是世界范圍內的主要致盲原因,目前還沒有藥物或者營養(yǎng)性的治療可以消除已經存在的白內障或者延緩其進展,通過手術摘除白內障是主要的治療方法.但由于植入人工晶體后失去調節(jié)能力以及存在發(fā)生后發(fā)性白內障(after cataract,或稱為后囊膜混濁,posterior capsular opacification,PCO)和眼內炎癥反應的可能,等等問題的出現(xiàn),都在一定程度上影響了治療的效果<'[1]>.更需要指出的是,發(fā)生PCO和需要行二次

2、激光手術的患者主要是年輕人,尤其是兒童<'[2]>,以及糖尿病性視網(wǎng)膜病變<'[3]>或者外傷性白內障<'[4]>的患者.因此,研究明確白內障以及后發(fā)性白內障的發(fā)病機理,從而尋求更為安全有效的非手術的防治方法是非常重要的. 前期的研究都說明,TGF-β<,2>在誘導前囊膜下白內障形成和促進后發(fā)性白內障形成過程中發(fā)揮著重要作用.隨著TGF-β<,2>對晶狀體作用的研究不斷深入,TGF-β<,2>發(fā)揮作用的機理受到廣泛的重視和研究,

3、本課題主要從研究TGF-β誘導晶狀體上皮細胞凋亡的機理入手,發(fā)現(xiàn)和分析了活性氧在該過程中發(fā)揮的重要調控作用;在此研究的同時,我們發(fā)現(xiàn)TGF-β<,2>處理后,仍有大部分晶狀體上皮細胞沒有發(fā)生凋亡,表現(xiàn)出對TGF-β<,2>處理的耐受并發(fā)生明顯的侵襲,我們對這一現(xiàn)象進行了分析后發(fā)現(xiàn),整合素β<,1>及其介導的蛋白激酶通路在該過程中作用明顯.在總結了以往關于TGF-β與白內障相關性研究的基礎上,本研究就TGF-β<,2>對晶狀體在各種生理病

4、理狀態(tài)下的影響進行了分析,對于全面闡明該細胞因子對晶狀體的作用和作用機理做出了積極的工作. 第一部分 轉化生長因子β2誘導的人晶狀體上皮細胞凋亡—— 活性氧的調節(jié)作用 [研究目的]：研究發(fā)現(xiàn),轉化生長因子β<,2>(transforming growth factorβ<,2>TGF.β<,2>)能夠抑制人晶狀體上皮細胞(human lens epithelial cells,HLECs)的增殖并誘導細胞發(fā)生凋亡,該過程

5、與晶狀體前囊膜下渾濁密切相關,但是這兩種過程中的信號傳導機制仍不明了.活性氧(reactive oxygen species,ROS)作為細胞內重要的信號傳導分子參與了眾多的細胞損傷過程,因此,我們的本部分的研究目的是研究ROS在TGF-β<,2>對HLECs的損傷過程中的作用,進而明確TGF-β<,2>對HIJECs的損傷機制. [研究方法]： 體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞株HLEB-3,用不同濃度的TGF-β<,2>處

6、理后,分別采用MTT和nJNEL法分析TGF-β<,2>對細胞增殖和凋亡的影響.應用熒光染料DCFHDA,測定細胞內活性氧的含量改變;并且,我們測定了細胞還原型谷胱甘肽(GSH)的含量以及采用實時熒光定量RT-PCR法測定了c-fos基因的mRNA含量的變化.最后,我們通過應用不同的活性氧清除劑,抑制細胞內活性氧的升高,測定對TGF-β<,2>誘導細胞增殖和凋亡兩個過程的影響. [研究結果]： TGF-β<,2>是晶狀體

7、上皮細胞重要的生長調節(jié)因子,并且可以引起細胞的凋亡.量效研究發(fā)現(xiàn)100 pg/ml TGF-β<,2>將引起細胞凋亡,而10 pg/mlTGF-β<,2>即可抑制細胞的增殖.在100pg/mlTGFβ<,2>引起HLECs凋亡的早期發(fā)現(xiàn)細胞內ROS含量明顯增高,并且降低了細胞內GSH含量,說明TGβ<,2>可以引起對HLECs的氧化性損傷.我們同時在研究c-fos這一受氧化狀態(tài)調節(jié)的重要基因的.mRNA表達中發(fā)現(xiàn),只有高濃度的TGF-β

8、<,2>(100 pg/m1)可以引起該基因的表達增高,其表達的變化情況和細胞經過氧化氫處理后的情況相似.最后,應用活性氧清除劑可以明顯降低甚至阻止細胞發(fā)生凋亡,但是不能改善細胞增殖受抑制的狀態(tài). [研究結論]： TGF-β<,2>能夠明顯抑制HLECs的增殖;并在達到一定濃度后誘導HLECs發(fā)生凋亡.ROS參與了TGF-β<,2>誘導凋亡的過程. 第二部分 轉化生長因子β<,2>誘導的人晶狀體上皮細胞移行和粘

9、附--整合素β<,1>及其相關的蛋白激酶通路的作用 [研究目的]： 在第一部分內容的基礎上我們發(fā)現(xiàn),TGF-β<,2>處理后,仍有大部分晶狀體上皮細胞沒有發(fā)生凋亡,表現(xiàn)出對TGF-β<,2>處理的耐受并出現(xiàn)出一定的侵襲現(xiàn)象.結合目前的其他研究的結果,白內障囊外摘除術后殘留的晶狀體上皮細胞是形成后發(fā)性白內障的重要原因,TGF-β<,2>也是參與該過程并起重要調節(jié)作用的細胞因子之一.因此,本部分的研究在第一部分的基礎上,進一

10、步發(fā)現(xiàn)了TGF-β<,2>對HELCs粘附和移行能力的影響,重點研究整合素β<,1>,這一在調節(jié)細胞粘附和移行方面重要的細胞表面分子的作用,以及整合素相關的粘著斑激酶 (focal adhesion kinase,FAK)的活化情況.進一步分析和闡明了TGF-β<,2>促進后發(fā)性白內障形成的機理. [研究方法]： 培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞株HLE B-3,用100 pg/ml的TGF-β<,2>處理后,檢測細胞粘附和移行的

11、改變.通過激光共聚焦及流式細胞儀測定細胞內整合素β<,1>亞型的蛋白表達,應用實時熒光定量RT-PCR法檢測整合素β<,1>的mRNA的表達.用Westem-blot法分別測定細胞內總FAK及其磷酸化Tyr 576蛋白的表達情況.最后,使用抗整合素β<,1>的單克隆抗體阻斷細胞內整合素β<,1>后,檢測對細胞粘附和移行的影響. [研究結果]： TGF-β<,2>可以引起HLECs的凋亡,但仍有>70﹪的細胞存活下來.TG

12、F-β<,2>的處理能夠引起該部分細胞粘附和移行力隨著時間的延長明顯升高;同時,細胞內整合素β<,1>的表達明顯升高(P<0.05);其相關的FAK的磷酸化水平明顯升高(P<0.05).應用抗整合素β<,1>的單克隆抗體預處理細胞后,能夠明顯抑制TGF-β<,2>引起的細胞粘附和移行. [研究結論]： TGF-β<,2>能夠明顯促進HLECs的粘附和移行;整合素β<,1>及其相關的FAK的磷酸化參與了該過程并發(fā)揮重要作用