漢防己甲素與氟康唑協(xié)同抗白念珠菌作用的比較蛋白組學研究.pdf

1、目的：
　　 白念珠菌病是最常見的人類機會真菌病原體，也是耳鼻喉科常見的一種病原體。近期感染率呈上升趨勢，在長期濫用抗生素，惡性腫瘤放療與化療，艾滋病，器官移植中使用免疫抑制劑的病人中尤為顯著。而臨床治療中存在著抗真菌藥物品種少，療效不滿意，毒性大等問題，尤其以唑類藥物耐藥性的獲得是臨床治療白念珠菌感染失敗的主要原因。因此，抗真菌藥物增效劑的研究成為必然。本研究在既往體內(nèi)體外、基因實驗的基礎上，應用差異蛋白組學從蛋白質水平探討漢

2、防已甲素增效作用的相關蛋白。
　　 方法：
　　 1.體外藥敏實驗和受試菌株時間-抑菌曲線
　　 參照美國國家臨床實驗室標準委員會(NCCLS)推薦的M27-A真菌藥物敏感性實驗方案，分別測定氟康唑單獨及聯(lián)合漢防己甲素時對16株白念珠菌酵母相的最小抑菌濃度(MIC)。選擇1株增效作用最為明顯的菌株繪制受試菌株時間-抑菌曲線，找到漢防已甲素增效的最佳藥物劑量及作用時間。
　　 2.白念珠菌裂解方法比較

3、>　　 以白念珠CA-3號菌株為實驗對象，采用3種不同白念珠菌的裂解方法：A：裂解液裂解法+液氮反復凍融法+超聲裂解法；B：熱SDS法+液氮反復凍融法+超聲裂解法+裂解液裂解法；C：熱SDS法+玻璃珠+液氮反復凍融法+超聲裂解法+裂解液裂解法，進行了蛋白的提取，通過倒置相差顯微鏡評價菌體的破壁率，通過蛋白提取液的濃度測定和SDS-PAGE電泳綜合對3種裂解方法進行評估。
　　 3.漢防已甲素與氟康唑協(xié)同抗白念珠菌作用的比較蛋白

4、組學
　　 以CA-3號菌株為實驗對象，通過二維電泳和時間-飛行質譜儀等方法，使菌株在氟康唑(終濃度750μg/ml)、漢防已甲素(終濃度250μg/ml)和氟康唑(終濃度750μg/ml)+漢防已甲素(終濃度250μg/ml)的藥液中分別作用6h，進行差異蛋白組學的研究。
　　 結果：
　　 1.體外藥敏實驗和受試菌株時間-抑菌曲線
　　 與漢防己甲素聯(lián)合使用時，氟康唑敏感株，氟康唑劑量依賴株和氟康唑耐

5、藥株的MIC終點清晰，“拖尾現(xiàn)象”消失，聯(lián)合漢防已甲素時，對11株氟康唑敏感株，3株氟康唑劑量依賴株和2株氟康唑耐藥株均有不同程度的增效作用，差異有統(tǒng)計學意義。其中CA-3的漢防己甲素增效作用最為明顯，以此菌株作為下一步的受試對象。時間-抑菌曲線結果提示當漢防已甲素(250μg/ml)和氟康唑(750μg/ml)聯(lián)合作用6h時抑菌效果最佳。
　　 2.白念珠菌裂解方法比較
　　 通過相差顯微鏡觀察方法A、B、C的細胞裂解

6、情況，方法A破壁率明顯較方法B和方法C高，三者破壁率分別為60％、20％、15％。
　　 以Bradford法測得方法A、B、C得到的蛋白質濃度分別為9.9±0.7，1.2±0.3，0.9±0.1 mg/ml。綜合考慮所得裂解產(chǎn)物濃度及SDS-PAGE電泳凝膠條帶的清晰度，我們選擇方法A進行下一步實驗。
　　 3.漢防已甲素與氟康唑協(xié)同抗白念珠菌作用的比較蛋白組學
　　 通過3次獨立的實驗分別提取了氟康唑、漢防已

7、甲素和氟康唑+漢防已甲素處理后樣本的全組蛋白，確定了9個蛋白差異點，排除漢防已甲素組與空白組中的上調點15號蛋白點后，確定了氟康唑+漢防已甲素組和氟康唑組的8個差異蛋白點，通過白念珠蛋白數(shù)據(jù)庫查詢，這8個蛋白分別為Pyruvate kinase，Enolase1，actin，Alcoholdehydrogenase，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，D-xylulose reductase

8、，possible sphingolipid long chain base sensory protein和一個未知蛋白。這些蛋白參與白念珠細胞壁的構成、糖代謝和能量代謝。
　　 結論：
　　 ①漢防已甲素可能通過影響白念珠菌細胞壁的合成和抑制白念珠菌的糖酵解、能量代謝等環(huán)節(jié)中產(chǎn)物的生成，以達到協(xié)同氟康唑的增效作用。
　　 ②Adh1p與漢防已甲素的增效作用相關，可能直接或間接通過Cdr1p起到增效作用。