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文檔簡(jiǎn)介
1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述:
第一部分 應(yīng)用掃描離子電導(dǎo)顯微鏡觀(guān)察糖尿病血管內(nèi)皮損傷
目的:應(yīng)用掃描離子電導(dǎo)顯微鏡(SICM)觀(guān)察糖尿病血管內(nèi)皮的損傷。
方法:本實(shí)驗(yàn)采用10-12周齡的糖尿病小鼠模型(db/db小鼠,C57BL/6J背景)以及同周齡的野生型C57BL/6J小鼠,通過(guò)傳統(tǒng)的免疫熒光和免疫組織化學(xué)染色法,以及新型SICM技術(shù)觀(guān)察db/db小鼠的胸主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷情況,并與野生型小鼠進(jìn)行對(duì)比;
2、急性分離野生型C57BL/6J小鼠的主動(dòng)脈,并進(jìn)行體外干預(yù)培養(yǎng),采用SICM技術(shù)觀(guān)察高糖(25 mM)和/或白介素-1β(interleukin,IL-1β)(25 ng/mL)對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)皮的損傷。
結(jié)果:(1)傳統(tǒng)的免疫熒光和免疫組織化學(xué)染色法可見(jiàn)野生型C57BL/6小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮基本完全覆蓋血管內(nèi)膜,未見(jiàn)顯著脫落;而db/db小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮存在明顯脫落和損傷。(2) SICM結(jié)果可見(jiàn):野生型C57BL/6小鼠的胸主動(dòng)脈
3、內(nèi)皮的三維和二維圖均可見(jiàn)內(nèi)皮光滑,內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,EC)飽滿(mǎn),呈橢圓形,排列緊密,大小約為20μm;而db/db小鼠的胸主動(dòng)脈內(nèi)皮可見(jiàn)內(nèi)皮不光滑,EC存在明顯脫落和損傷,內(nèi)皮化的面積顯著下降。(3)采用高糖和/或IL-1β干預(yù)主動(dòng)脈內(nèi)皮,并進(jìn)行SICM掃描,結(jié)果顯示正常糖濃度(5.6 mM)培養(yǎng)后胸主動(dòng)脈未見(jiàn)明顯脫落和損傷;高糖(25mM)干預(yù)培養(yǎng)后EC出現(xiàn)皺縮,但無(wú)明顯脫落;單獨(dú)IL-1β干預(yù)培養(yǎng)后,胸主
4、動(dòng)脈內(nèi)皮仍未見(jiàn)明顯脫落;而高糖聯(lián)合IL-1β干預(yù)培養(yǎng)后,胸主動(dòng)脈內(nèi)皮出現(xiàn)明顯損傷和脫落,內(nèi)皮化面積的比例顯著下降。
結(jié)論:SICM是一種新型觀(guān)察內(nèi)皮損傷的技術(shù),具有分辨率高、操作簡(jiǎn)單、對(duì)觀(guān)察組織無(wú)損傷的特點(diǎn)。
第二部分 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
目的:分離得到高純度和活性的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC),并進(jìn)行體外培養(yǎng)及
5、鑒定。
方法:采用0.1%Ⅰ型膠原酶灌注消化法和Promocell公司提供的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基及其輔劑(不含VEGF)進(jìn)行分離和培養(yǎng),并根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、成管實(shí)驗(yàn)和CD31免疫熒光染色對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
結(jié)果:(1)0.1%Ⅰ型膠原酶灌注消化時(shí)間控制在15-18 min內(nèi)可獲得大量細(xì)胞。(2)倒置顯微鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn):HUVEC在接種初始為圓形,單個(gè)或聚集成團(tuán),4h后開(kāi)始貼壁,24 h后即可完全貼壁,早期細(xì)胞形態(tài)呈三角形、短梭
6、形、梭形或者不規(guī)則形,細(xì)胞邊界清晰,細(xì)胞核為圓形或橢圓形,核仁明顯;3-5天后細(xì)胞可連接成片,逐漸生長(zhǎng)為單層,呈“鋪路石樣”,并且無(wú)堆疊,呈典型的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)。(3) CD31免疫熒光染色結(jié)果表明所提取的細(xì)胞呈明顯的CD31陽(yáng)性,CD31陽(yáng)性細(xì)胞率大于95%;所提取的細(xì)胞在1h左右即可成管。(4) HUVEC接種后24 h開(kāi)始生長(zhǎng);2-4天生長(zhǎng)速度加快,維持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;5天起細(xì)胞發(fā)生接觸抑制,進(jìn)入停滯期;細(xì)胞倍增時(shí)間約為24 h。
7、
結(jié)論:采用0.1%Ⅰ型膠原酶灌注消化法所提取的HUVEC純度高、活力好,所采用的提取方法合理、適當(dāng)。
第三部分 單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體4在糖尿病內(nèi)皮損傷中的作用
目的:檢測(cè)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(monocarboxylate transporter,MCT)在HUVEC上的表達(dá)以及高糖和/或IL-1β對(duì)MCT4表達(dá)的影響,并探討MCT4對(duì)HUVEC胞內(nèi)乳酸、pH水平及功能的影響。
方法:分離HUVEC,采用PCR
8、和real-time PCR檢測(cè)MCT在HUVEC中的表達(dá);采用real-time PCR、Western blot及免疫熒光染色檢測(cè)高糖(25 mM)和/或IL-1β(25 ng/mL)干預(yù)對(duì)MCT4表達(dá)的影響;通過(guò)特異性shRNA轉(zhuǎn)染沉默MCT4,采用ELISA、BCECF熒光染色、TUNEL、Western blot、CCK-8、劃痕和transwell小室等方法,探討MCT4沉默對(duì)細(xì)胞內(nèi)乳酸、pH值以及細(xì)胞凋亡、增殖和遷移的影響
9、。
結(jié)果:(1)在HUVEC中,除MCT10和MCT11外,其余的MCT均有表達(dá),且MCT1和MCT4的mRNA水平顯著高于MCT2和MCT3。(2)單獨(dú)高糖(25 mM)或者IL-1β可引起HUVEC的凋亡,而與單獨(dú)高糖或者IL-1β相比,高糖聯(lián)合IL-1β干預(yù)可增加這種促凋亡的作用;高糖聯(lián)合IL-1β干預(yù)上調(diào)促凋亡的BAX蛋白表達(dá),而抑制抗凋亡的Bcl-2的蛋白表達(dá)。(3)細(xì)胞內(nèi)乳酸檢測(cè)結(jié)果顯示:與正常糖濃度組相比,單獨(dú)高
10、糖或者IL-1β干預(yù)并不增加細(xì)胞內(nèi)乳酸水平,而高糖聯(lián)合IL-1β可使細(xì)胞內(nèi)乳酸增加大約2倍。(4)高糖并不影響MCT4mRNA和蛋白的水平,以及其在細(xì)胞膜上的定位;而高糖聯(lián)合IL-1β顯著降低了MCT4的mRNA和蛋白水平,并減少其在細(xì)胞膜上的定位。(5) MCT4沉默顯著增加細(xì)胞內(nèi)乳酸水平并降低細(xì)胞內(nèi)的pH值。(6) MCT4沉默誘導(dǎo)HUVEC的凋亡,上調(diào)BAX的蛋白水平并下調(diào)Bcl-2的蛋白水平。(7)MCT4沉默抑制HUVEC的增
11、殖。(8)MCT4沉默抑制HUVEC的遷移。
結(jié)論:高糖引起的HUVEC凋亡以及增殖和遷移受抑制可能與MCT4表達(dá)下調(diào)有關(guān)。
第四部分 單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體4介導(dǎo)糖尿病內(nèi)皮損傷的機(jī)制研究
目的:探討MCT4介導(dǎo)糖尿病內(nèi)皮損傷的機(jī)制。
方法:分離HUVEC,通過(guò)特異性shRNA轉(zhuǎn)染沉默MCT4,采用Western blot、CCK-8、劃痕和transwell小室等方法,探討MCT4沉默對(duì)Akt/Gsk3β
12、、MEK/Erk以及integrinβ4/FAK/Src信號(hào)通路的影響。
結(jié)果:(1) MCT4沉默顯著抑制了HUVEC的增殖;Akt抑制劑LY294002或MEK抑制劑AZD6244干預(yù)顯著抑制了HUVEC的增殖;而MCT4沉默聯(lián)合應(yīng)用LY294002或AZD6244干預(yù),進(jìn)一步抑制了細(xì)胞增殖。(2) MCT4沉默后p-Akt、p-Gsk3β、p-MEK和p-Erk1/2的水平顯著降低;采用LY294002和AZD6244干
13、預(yù)后,同樣發(fā)現(xiàn)p-Akt、p-Gsk3β、p-MEK和p-Erk1/2的水平顯著降低;而MCT4沉默聯(lián)合抑制劑干預(yù),其蛋白的磷酸化水平更低。(3) MCT4沉默顯著抑制了HUVEC的遷移;單獨(dú)特異性FAK抑制劑PF-573228干預(yù)也顯著抑制了HUVEC的遷移;而MCT4沉默聯(lián)合應(yīng)用PF-573228干預(yù)進(jìn)一步抑制HUVEC的遷移。(4) MCT4沉默后integrinβ4、p-FAK和p-Src的水平顯著降低;單獨(dú)采用PF-57322
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