活動性肺結(jié)核及潛伏結(jié)核感染者外周血中鋅離子及鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體ZIP2的研究.pdf

1、目的：
　　本課題從人體（肺結(jié)核患者、潛伏性肺結(jié)核患者及其健康人群）細(xì)胞亞群水平、細(xì)胞水平、分子水平之上探討水平鋅離子豐度及鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體ZIP2在機(jī)體針對結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答中的作用，以及觀察潛伏肺結(jié)核患者于活動性肺結(jié)核患者鋅離子含量與鋅表達(dá)的差異，了解鋅的表達(dá)是否與接觸結(jié)核菌后是否發(fā)病。進(jìn)一步探討是否對進(jìn)一步尋找人類感染結(jié)核病的免疫系統(tǒng)病因、發(fā)現(xiàn)結(jié)核病治療新的分

2、子靶點(diǎn)位置和療效指標(biāo)提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。
　　機(jī)體感染MTB，一部分人群不出現(xiàn)臨床癥狀而形成潛伏的結(jié)核感染(latenttuberculosis infection，LTBI)。國內(nèi)外許多項(xiàng)研究表明，LTBI發(fā)展為活動性結(jié)核病人的幾率為4％-11％，尤其是感染后前兩年的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)更大。這些人群中，可能會有10％左右的人轉(zhuǎn)變?yōu)榛顒有越Y(jié)核病人，在這10％的人群之中，有一半的感染者會在感染后的前2-4年發(fā)病;剩下的一半人群，當(dāng)機(jī)體的免疫力

3、出現(xiàn)下降時(shí)，會在以后的任何時(shí)候發(fā)病。因此，LTBI者成為結(jié)核患者的重要來源之一。
　　鋅(Zinc，Zn)是生物體必須的一種重要微量元素，一般作為鋅離子狀態(tài)存在。它作為50余種酶和約300多種輔酶的輔助因子，其廣泛參與人體物質(zhì)代謝、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞生長、成熟和分化。根據(jù)國內(nèi)外報(bào)道我們得知，在人類基因庫中大約有10％左右的蛋白質(zhì)是鋅相關(guān)性結(jié)合蛋白，因此許多生命進(jìn)程都是鋅密切依賴性的過程，因此鋅又被大家譽(yù)為“生命元素”。
　　鋅與

4、免疫系統(tǒng)的功能密切相關(guān)，不僅具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞有絲分裂、增加T淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞的數(shù)量和活力、提高機(jī)體抗感染等作用，然而鋅離子水平過高，也會產(chǎn)生較大的毒性，會影響機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致神經(jīng)毒性。正常機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的鋅離子濃度處于穩(wěn)態(tài)，如果該濃度穩(wěn)態(tài)由于某種原因失衡，會導(dǎo)致包括免疫系統(tǒng)在內(nèi)的多系統(tǒng)發(fā)生疾病?，F(xiàn)已證明的是，缺鋅可引起胸腺細(xì)胞萎縮、胸腺激素分泌減少、T細(xì)胞功能受損及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能發(fā)生下調(diào)。
　　細(xì)胞內(nèi)鋅濃度的再分布是維持

5、機(jī)體鋅穩(wěn)態(tài)的基本環(huán)節(jié)，但是鋅離子不能自由通過細(xì)胞膜，只能在一類被稱作鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體(Zinc transporter)的特殊膜蛋白協(xié)助下才能完成。在哺乳動物中，這類蛋白主要包括2個(gè)家族成員:鋅鐵調(diào)控樣蛋白(Zrt-and Irt-like proteins，ZIP)家族和陽離子擴(kuò)散促進(jìn)因子(cation diffusion facilitator，CDF)家族（也稱ZnT家族）。這兩類鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體在細(xì)胞內(nèi)、外鋅轉(zhuǎn)運(yùn)的方向上及途徑上起著相反的作用:

6、ZIP能夠增加鋅的內(nèi)流攝取或者促進(jìn)細(xì)胞器內(nèi)鋅的釋放，來增加胞漿中鋅的含量，而ZnT能夠促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)鋅的外流以及使鋅在各細(xì)胞器內(nèi)區(qū)室化改變，從而降低胞漿鋅的含量。特別一提的是hZIP2是在2000年被發(fā)現(xiàn)的人類第一個(gè)可特異攝取鋅離子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
　　當(dāng)機(jī)體感染MTB后，機(jī)體會立即啟動一系列復(fù)雜的免疫應(yīng)答機(jī)制，用以對抗或消滅細(xì)菌的入侵:首先，MTB逐步侵入單核巨噬細(xì)胞，在人體中該種細(xì)胞是發(fā)揮非特異性免疫反應(yīng)的主要靶細(xì)胞。單核巨噬細(xì)胞又可

7、作為抗原抗體遞呈細(xì)胞，刺激T淋巴細(xì)胞啟動特異性免疫應(yīng)答，介導(dǎo)Ⅳ型誘導(dǎo)的超敏反應(yīng):CD8+的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)通過識別靶細(xì)胞，釋放穿孔素和（或）顆粒溶素等誘導(dǎo)細(xì)胞溶解凋亡，破壞MTB生長環(huán)境，使新增抗原遞呈而起到免疫監(jiān)視的作用;CD4+的輔助性T細(xì)胞(Help T cell，Th)通過分泌各種細(xì)胞因子影響免疫應(yīng)答的類型與強(qiáng)度。根據(jù)分泌細(xì)胞因子的不同，可被分為Th1、Th2兩種不同功能的亞群。以干擾素-γ(IFN-γ)為主的Th1型細(xì)

8、胞因子起到保護(hù)性免疫應(yīng)答的作用。Th2型細(xì)胞因子上調(diào)時(shí)則會抑制INF-γ等的產(chǎn)生，降低巨噬細(xì)胞、NK等細(xì)胞的吞噬殺滅MTB能力，從而削弱機(jī)體保護(hù)性免疫應(yīng)答反應(yīng)。在炎癥發(fā)生發(fā)展過程中Th1、Th2細(xì)胞因子能否平衡，將出現(xiàn)抗感染或者損傷組織的不同結(jié)果，進(jìn)而影響結(jié)核病人疾病的轉(zhuǎn)歸過程。Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答能力低下或不足是結(jié)核病患者最顯著的細(xì)胞免疫特征。
　　雖然全球已有近1/3的人口感染MTB，但最終只有其中的10％發(fā)展成為肺結(jié)核。如果機(jī)

9、體免疫系統(tǒng)抗MTB的應(yīng)答效果不佳或不足，結(jié)核菌在體內(nèi)則可能導(dǎo)致進(jìn)一步的發(fā)病或者形成長期潛伏感染狀態(tài)。已有的研究結(jié)果表明，結(jié)核病患者細(xì)胞免疫功能低下、血液中鋅的含量較正常人群都存在偏低?？梢?，鋅離子在結(jié)核病患者機(jī)體免疫系統(tǒng)應(yīng)答中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，而機(jī)體中鋅離子水平與調(diào)控它的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體功能作用密不可分。
　　前期研究發(fā)現(xiàn):與健康組對比，活動性肺結(jié)核患者中血清鋅水平降低，外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononucl

10、ear cell，PBMC)ZIP2的mRNA表達(dá)水平、蛋白水平均出現(xiàn)明顯升高，利用SiRNA技術(shù)敲除ZIP2基因表達(dá)后，活動性肺結(jié)核患者中PBMC的ZIP2 mRNA表達(dá)水平下降，同時(shí)與之密切相關(guān)的IFN-γ表達(dá)下降。因此，我們推測ZIP2及鋅濃度在結(jié)核病病人的免疫系統(tǒng)應(yīng)答中有可能發(fā)揮了極其重要的作用。通過檢索，我們發(fā)現(xiàn)國內(nèi)、外目前尚沒有探討關(guān)于鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體與結(jié)核病患者低鋅水平、免疫功能低下之間關(guān)系的研究。同樣，也無關(guān)于結(jié)核病人鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體Z

11、IP2在機(jī)體抗結(jié)核分枝桿菌免疫應(yīng)答中作用的研究。
　　因此，非常有必要在一些前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從人體免疫細(xì)胞亞群水平、細(xì)胞水平、分子水平上探討人鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體ZIP2在機(jī)體針對MTB所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答中的作用。我們大膽假設(shè)是:如果不同個(gè)體在接觸MTB后，他們發(fā)病與否或者發(fā)生肺結(jié)核的這種差異主要是由于不同個(gè)體的ZIP2表達(dá)異常、鋅水平低下造成免疫系統(tǒng)應(yīng)答異常所導(dǎo)致的，那么ZIP2、鋅水平很可能是人群對MTB的易感的因素之一;如果成立，

12、那么我們可以從一個(gè)全新的角度探明肺結(jié)核發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)理;還可以將ZIP2、鋅作為新的結(jié)核病治療靶點(diǎn)和療效觀測指標(biāo)，從而指導(dǎo)臨床對結(jié)核患者進(jìn)行更準(zhǔn)確的治療和療效及預(yù)后評估。
　　方法：
　　本課題從人體免疫細(xì)胞亞群水平和這2個(gè)角度，用分子生物實(shí)驗(yàn)學(xué)技術(shù)，探討ZIP2在不同的疾病中表達(dá)，證實(shí)結(jié)核病人中鋅豐度及ZIP2mRNA與其他疾病的差異。
　　將受試對象分3個(gè)組，活動性肺結(jié)核組(Active pulmonary tub

13、erculosis，APTB)、潛伏性肺結(jié)核組(Latent tuberculosis infection，LTBI)、健康對照組(Control)。APTB組診斷依據(jù)國家衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，健康對照組要求無結(jié)核病接觸史。對于健康對照組可以分為潛伏性結(jié)核組和正常對照組。對上述3組受試對象經(jīng)倫理學(xué)委員會同意，并簽訂知情同意書后，抽取外周靜脈抗凝全血進(jìn)行如下試驗(yàn):(1)血漿鋅離子含量;(2)使用美國BD公司的Cytometric Bead Arr

14、ay(CBA)試劑盒，對三個(gè)研究組對象的外周血血清學(xué)樣本進(jìn)行IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF、IFN-γ共6種Th1/Th2細(xì)胞因子的檢測。(3)本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，在APTB、LTBI、Control三組間對ZIP2的相對表達(dá)水平進(jìn)行測定。(4)利用流式細(xì)胞分選技術(shù)將各組受試對象的CD4+的輔助性T淋巴細(xì)進(jìn)行分選，并進(jìn)行ZIP2指標(biāo)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。(5)橫向?qū)Ρ華PTB組PBMC和外周血CD4+

15、T淋巴細(xì)胞的ZIP2水平。
　　用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，對上述指標(biāo)進(jìn)行組間、細(xì)胞間的差異分析和組內(nèi)各指標(biāo)的相關(guān)性分型。
　　結(jié)果：
　　APTB組的IL-10濃度明顯高于LTBI組和Control組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P＜0.05)，IL-10在LTBI組和Control組之間呈較低的濃度水平，并且兩組間無顯著性的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;(2) IFN-γ在APTB組(p=0.001)和LTBI(P＜0.05)組中均呈現(xiàn)較高的濃度水平

16、，相對于Control組而言，兩組的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。此外，APTB組的IFN-γ水平較之LTBI組更高，并且兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。APTB組外周血PBMC中的ZIP2水平明顯高于LTBI和Control兩組，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001)，LTBI和Control兩組的ZIP2水平相當(dāng)，不具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。APTB組外周血CD4+T淋巴細(xì)胞的ZIP2水平明顯高于LTBI和Control兩組，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差

17、異(P=0.001)，LTBI和Control兩組的ZIP2水平相當(dāng)，不具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CD4+T淋巴細(xì)胞中的ZIP2高水平表達(dá)，可能是造成PBMC中ZIP2高水平表達(dá)的主要角色。APTB組外周血血清鋅離子水平明顯低于LTBI和Control兩組，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);雖然LTBI較之Control組，其血清鋅離子濃度也略低，但統(tǒng)計(jì)學(xué)差異并不明顯。
　　結(jié)論：
　　對三組研究對象進(jìn)行分析，我們得出活動性

18、肺結(jié)核組鋅離子水平顯著降低，但潛伏性結(jié)核患者鋅離子水平相比正常健康人群略低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示鋅水平可能是機(jī)體感染結(jié)核菌后是否發(fā)病的重要因素。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)活動性肺結(jié)核組中IL-10、PBMC中的ZIP2水平、CD4+T淋巴細(xì)胞中的ZIP2水平表達(dá)或含量都較另外兩組高，而PBMC、CD4+T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫，尤其是結(jié)核菌感染機(jī)體后誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫的重要環(huán)節(jié)，因此提示有可能是免疫細(xì)胞的缺鋅狀態(tài)導(dǎo)致結(jié)核菌不易控制，發(fā)展成活動性肺結(jié)核。