活動性肺結核及潛伏結核感染者外周血中鋅離子及鋅離子轉運體ZIP2的研究.pdf

1、目的：
　　本課題從人體（肺結核患者、潛伏性肺結核患者及其健康人群）細胞亞群水平、細胞水平、分子水平之上探討水平鋅離子豐度及鋅轉運體ZIP2在機體針對結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）所產生的免疫應答中的作用，以及觀察潛伏肺結核患者于活動性肺結核患者鋅離子含量與鋅表達的差異，了解鋅的表達是否與接觸結核菌后是否發(fā)病。進一步探討是否對進一步尋找人類感染結核病的免疫系統(tǒng)病因、發(fā)現(xiàn)結核病治療新的分

2、子靶點位置和療效指標提供理論和技術基礎。
　　機體感染MTB，一部分人群不出現(xiàn)臨床癥狀而形成潛伏的結核感染(latenttuberculosis infection，LTBI)。國內外許多項研究表明，LTBI發(fā)展為活動性結核病人的幾率為4％-11％，尤其是感染后前兩年的發(fā)病風險更大。這些人群中，可能會有10％左右的人轉變?yōu)榛顒有越Y核病人，在這10％的人群之中，有一半的感染者會在感染后的前2-4年發(fā)病;剩下的一半人群，當機體的免疫力

3、出現(xiàn)下降時，會在以后的任何時候發(fā)病。因此，LTBI者成為結核患者的重要來源之一。
　　鋅(Zinc，Zn)是生物體必須的一種重要微量元素，一般作為鋅離子狀態(tài)存在。它作為50余種酶和約300多種輔酶的輔助因子，其廣泛參與人體物質代謝、基因轉錄、細胞生長、成熟和分化。根據(jù)國內外報道我們得知，在人類基因庫中大約有10％左右的蛋白質是鋅相關性結合蛋白，因此許多生命進程都是鋅密切依賴性的過程，因此鋅又被大家譽為“生命元素”。
　　鋅與

4、免疫系統(tǒng)的功能密切相關，不僅具有促進淋巴細胞有絲分裂、增加T淋巴細胞、單核巨噬細胞的數(shù)量和活力、提高機體抗感染等作用，然而鋅離子水平過高，也會產生較大的毒性，會影響機體的神經系統(tǒng)，導致神經毒性。正常機體細胞內的鋅離子濃度處于穩(wěn)態(tài)，如果該濃度穩(wěn)態(tài)由于某種原因失衡，會導致包括免疫系統(tǒng)在內的多系統(tǒng)發(fā)生疾病?，F(xiàn)已證明的是，缺鋅可引起胸腺細胞萎縮、胸腺激素分泌減少、T細胞功能受損及細胞介導的免疫功能發(fā)生下調。
　　細胞內鋅濃度的再分布是維持

5、機體鋅穩(wěn)態(tài)的基本環(huán)節(jié)，但是鋅離子不能自由通過細胞膜，只能在一類被稱作鋅轉運體(Zinc transporter)的特殊膜蛋白協(xié)助下才能完成。在哺乳動物中，這類蛋白主要包括2個家族成員:鋅鐵調控樣蛋白(Zrt-and Irt-like proteins，ZIP)家族和陽離子擴散促進因子(cation diffusion facilitator，CDF)家族（也稱ZnT家族）。這兩類鋅轉運體在細胞內、外鋅轉運的方向上及途徑上起著相反的作用:

6、ZIP能夠增加鋅的內流攝取或者促進細胞器內鋅的釋放，來增加胞漿中鋅的含量，而ZnT能夠促進細胞質鋅的外流以及使鋅在各細胞器內區(qū)室化改變，從而降低胞漿鋅的含量。特別一提的是hZIP2是在2000年被發(fā)現(xiàn)的人類第一個可特異攝取鋅離子的轉運蛋白。
　　當機體感染MTB后，機體會立即啟動一系列復雜的免疫應答機制，用以對抗或消滅細菌的入侵:首先，MTB逐步侵入單核巨噬細胞，在人體中該種細胞是發(fā)揮非特異性免疫反應的主要靶細胞。單核巨噬細胞又可

7、作為抗原抗體遞呈細胞，刺激T淋巴細胞啟動特異性免疫應答，介導Ⅳ型誘導的超敏反應:CD8+的細胞毒性T細胞(CTL)通過識別靶細胞，釋放穿孔素和（或）顆粒溶素等誘導細胞溶解凋亡，破壞MTB生長環(huán)境，使新增抗原遞呈而起到免疫監(jiān)視的作用;CD4+的輔助性T細胞(Help T cell，Th)通過分泌各種細胞因子影響免疫應答的類型與強度。根據(jù)分泌細胞因子的不同，可被分為Th1、Th2兩種不同功能的亞群。以干擾素-γ(IFN-γ)為主的Th1型細

8、胞因子起到保護性免疫應答的作用。Th2型細胞因子上調時則會抑制INF-γ等的產生，降低巨噬細胞、NK等細胞的吞噬殺滅MTB能力，從而削弱機體保護性免疫應答反應。在炎癥發(fā)生發(fā)展過程中Th1、Th2細胞因子能否平衡，將出現(xiàn)抗感染或者損傷組織的不同結果，進而影響結核病人疾病的轉歸過程。Th1細胞免疫應答能力低下或不足是結核病患者最顯著的細胞免疫特征。
　　雖然全球已有近1/3的人口感染MTB，但最終只有其中的10％發(fā)展成為肺結核。如果機

9、體免疫系統(tǒng)抗MTB的應答效果不佳或不足，結核菌在體內則可能導致進一步的發(fā)病或者形成長期潛伏感染狀態(tài)。已有的研究結果表明，結核病患者細胞免疫功能低下、血液中鋅的含量較正常人群都存在偏低?？梢?，鋅離子在結核病患者機體免疫系統(tǒng)應答中發(fā)揮了關鍵性作用，而機體中鋅離子水平與調控它的鋅轉運體功能作用密不可分。
　　前期研究發(fā)現(xiàn):與健康組對比，活動性肺結核患者中血清鋅水平降低，外周血單個核細胞(Peripheral blood mononucl

10、ear cell，PBMC)ZIP2的mRNA表達水平、蛋白水平均出現(xiàn)明顯升高，利用SiRNA技術敲除ZIP2基因表達后，活動性肺結核患者中PBMC的ZIP2 mRNA表達水平下降，同時與之密切相關的IFN-γ表達下降。因此，我們推測ZIP2及鋅濃度在結核病病人的免疫系統(tǒng)應答中有可能發(fā)揮了極其重要的作用。通過檢索，我們發(fā)現(xiàn)國內、外目前尚沒有探討關于鋅轉運體與結核病患者低鋅水平、免疫功能低下之間關系的研究。同樣，也無關于結核病人鋅轉運體Z

11、IP2在機體抗結核分枝桿菌免疫應答中作用的研究。
　　因此，非常有必要在一些前期研究的基礎上，進一步從人體免疫細胞亞群水平、細胞水平、分子水平上探討人鋅轉運體ZIP2在機體針對MTB所產生的免疫應答中的作用。我們大膽假設是:如果不同個體在接觸MTB后，他們發(fā)病與否或者發(fā)生肺結核的這種差異主要是由于不同個體的ZIP2表達異常、鋅水平低下造成免疫系統(tǒng)應答異常所導致的，那么ZIP2、鋅水平很可能是人群對MTB的易感的因素之一;如果成立，

12、那么我們可以從一個全新的角度探明肺結核發(fā)病的免疫學機理;還可以將ZIP2、鋅作為新的結核病治療靶點和療效觀測指標，從而指導臨床對結核患者進行更準確的治療和療效及預后評估。
　　方法：
　　本課題從人體免疫細胞亞群水平和這2個角度，用分子生物實驗學技術，探討ZIP2在不同的疾病中表達，證實結核病人中鋅豐度及ZIP2mRNA與其他疾病的差異。
　　將受試對象分3個組，活動性肺結核組(Active pulmonary tub

13、erculosis，APTB)、潛伏性肺結核組(Latent tuberculosis infection，LTBI)、健康對照組(Control)。APTB組診斷依據(jù)國家衛(wèi)生行業(yè)標準，健康對照組要求無結核病接觸史。對于健康對照組可以分為潛伏性結核組和正常對照組。對上述3組受試對象經倫理學委員會同意，并簽訂知情同意書后，抽取外周靜脈抗凝全血進行如下試驗:(1)血漿鋅離子含量;(2)使用美國BD公司的Cytometric Bead Arr

14、ay(CBA)試劑盒，對三個研究組對象的外周血血清學樣本進行IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF、IFN-γ共6種Th1/Th2細胞因子的檢測。(3)本研究通過實時熒光定量PCR技術，在APTB、LTBI、Control三組間對ZIP2的相對表達水平進行測定。(4)利用流式細胞分選技術將各組受試對象的CD4+的輔助性T淋巴細進行分選，并進行ZIP2指標的實時熒光定量PCR檢測。(5)橫向對比APTB組PBMC和外周血CD4+

15、T淋巴細胞的ZIP2水平。
　　用SPSS統(tǒng)計學軟件，對上述指標進行組間、細胞間的差異分析和組內各指標的相關性分型。
　　結果：
　　APTB組的IL-10濃度明顯高于LTBI組和Control組，統(tǒng)計學差異顯著(P＜0.05)，IL-10在LTBI組和Control組之間呈較低的濃度水平，并且兩組間無顯著性的統(tǒng)計學差異;(2) IFN-γ在APTB組(p=0.001)和LTBI(P＜0.05)組中均呈現(xiàn)較高的濃度水平

16、，相對于Control組而言，兩組的統(tǒng)計學差異顯著。此外，APTB組的IFN-γ水平較之LTBI組更高，并且兩組間具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。APTB組外周血PBMC中的ZIP2水平明顯高于LTBI和Control兩組，具有明顯的統(tǒng)計學差異(P=0.001)，LTBI和Control兩組的ZIP2水平相當，不具有明顯的統(tǒng)計學差異。APTB組外周血CD4+T淋巴細胞的ZIP2水平明顯高于LTBI和Control兩組，具有明顯的統(tǒng)計學差

17、異(P=0.001)，LTBI和Control兩組的ZIP2水平相當，不具有明顯的統(tǒng)計學差異。CD4+T淋巴細胞中的ZIP2高水平表達，可能是造成PBMC中ZIP2高水平表達的主要角色。APTB組外周血血清鋅離子水平明顯低于LTBI和Control兩組，具有明顯的統(tǒng)計學差異(P＜0.05);雖然LTBI較之Control組，其血清鋅離子濃度也略低，但統(tǒng)計學差異并不明顯。
　　結論：
　　對三組研究對象進行分析，我們得出活動性

18、肺結核組鋅離子水平顯著降低，但潛伏性結核患者鋅離子水平相比正常健康人群略低，但無統(tǒng)計學意義。提示鋅水平可能是機體感染結核菌后是否發(fā)病的重要因素。我們進一步研究發(fā)現(xiàn)活動性肺結核組中IL-10、PBMC中的ZIP2水平、CD4+T淋巴細胞中的ZIP2水平表達或含量都較另外兩組高，而PBMC、CD4+T淋巴細胞是機體免疫，尤其是結核菌感染機體后誘導的細胞免疫的重要環(huán)節(jié)，因此提示有可能是免疫細胞的缺鋅狀態(tài)導致結核菌不易控制，發(fā)展成活動性肺結核。