AHSG基因的原核表達(dá)及其在原發(fā)性肝癌診斷中的價(jià)值.pdf

1、a2-HS糖蛋白(Alpha2-Heremans-Schmid glycoprotein,AHSG)是一種存在于人體血清中的一種糖蛋白,目前的研究顯示,原發(fā)性肝癌患者血清中該蛋白的自身抗體水平顯著高于正常人,提示其有可能成為診斷原發(fā)性肝癌的一種血清學(xué)標(biāo)志物。本研究通過(guò)原核表達(dá)的方法獲得AHSG重組蛋白,并用其作為腫瘤相關(guān)抗原檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者、慢性肝病患者和正常人血清中抗AHSG抗體的水平,評(píng)價(jià)其單獨(dú)和并聯(lián)其它腫瘤相關(guān)抗原作為原發(fā)性肝癌

2、診斷指標(biāo)的價(jià)值。
　　 方法：
　　 1.RT-PCR擴(kuò)增AHSG基因:提取HepG2細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄cDNA,以cDNA為模板,設(shè)計(jì)特異性引物,加入限制性酶切位點(diǎn),擴(kuò)增目的基因。
　　 2.構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒及鑒定:將AHSG基因與pMD-18T載體連接,構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒(AHSG-T),將重組克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a細(xì)胞中,通過(guò)酶切鑒定、特異PCR鑒定和測(cè)序確定克隆質(zhì)粒的正確性；用限制性內(nèi)切酶將目的基

3、因從克隆質(zhì)粒上切下,再與表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)連接,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-AHSG,并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a細(xì)胞中,通過(guò)酶切及特異PCR擴(kuò)增的方法鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。
　　 3.將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21中,構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)BL21(pET30a-AHSG)。
　　 4.確定最佳誘導(dǎo)條件:確定重組蛋白AHSG表達(dá)所需的最佳IPTG誘導(dǎo)濃度和最佳誘導(dǎo)時(shí)間。
　　 5.

4、可溶性分析:大量誘導(dǎo)AHSG重組蛋白表達(dá),通過(guò)可溶性分析確定AHSG重組蛋白的主要表達(dá)形式,優(yōu)化誘導(dǎo)條件增加可溶性蛋白的表達(dá)量。
　　 6.蛋白純化:通過(guò)鎳離子親和層析的方法純化帶有組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白,并測(cè)定純化蛋白的濃度,用Western blot鑒定重組蛋白。
　　 7.通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者、慢性肝病患者和正常人血清中的AHSG抗體,比較其在原發(fā)性肝癌患者、慢性肝病患者和正常人血

5、清中的水平。
　　 8.以正常人血清中AHSG抗體含量的百分位數(shù)P95作為截?cái)嘀?計(jì)算肝癌組、慢性肝病組和正常組AHSG抗體陽(yáng)性率,用篩檢試驗(yàn)的評(píng)價(jià)方法評(píng)價(jià)AHSG檢測(cè)原發(fā)性肝癌的診斷價(jià)值。
　　 9.并聯(lián)14種腫瘤相關(guān)抗原(AHSG、Calnuc、CyclinE、CDK2、cIAP、RalA、p62、p53、CyclinB1、Koc、Impl、survivin、p16、C-myc)對(duì)原發(fā)性肝癌進(jìn)行診斷,篩選并評(píng)價(jià)診斷原

6、發(fā)性肝癌的最佳組合。
　　 結(jié)果：
　　 成功構(gòu)建AHSG原核表達(dá)系統(tǒng)BL21(pET30a-AHSG)；最佳誘導(dǎo)條件為0.08mmol/L,IPTG誘導(dǎo)3h；可溶性分析顯示目的蛋白主要以不溶性的包涵體形式存在；5mol/L尿素洗滌包涵體的效果最佳；通過(guò)鎳離子親和層析的方法純化到AHSG重組蛋白,并經(jīng)蛋白免疫印跡雜交確定了純化蛋白的正確性。
　　 ELISA結(jié)果顯示,原發(fā)性肝癌患者血清中AHSG抗體水平高于慢性肝

7、病患者和正常人,AHSG檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者的靈敏度僅為13.1％,診斷價(jià)值較低。并聯(lián)9種TAAs可使檢測(cè)的靈敏度提高到89.8％,特異度為86.8％。9種抗原聯(lián)合檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為86.3％,陽(yáng)性似然比為6.80,陰性預(yù)測(cè)值為90.2％,陰性似然比為0.12。這些指標(biāo)說(shuō)明聯(lián)合檢測(cè)的診斷價(jià)值較高,具有較高的臨床診斷價(jià)值。Kappa值為0.76,則說(shuō)明該試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果與真實(shí)值中度一致。
　　 結(jié)論：
　　 成功構(gòu)建AHSG基