AHSG基因的原核表達及其在原發(fā)性肝癌診斷中的價值.pdf

1、a2-HS糖蛋白(Alpha2-Heremans-Schmid glycoprotein,AHSG)是一種存在于人體血清中的一種糖蛋白,目前的研究顯示,原發(fā)性肝癌患者血清中該蛋白的自身抗體水平顯著高于正常人,提示其有可能成為診斷原發(fā)性肝癌的一種血清學(xué)標志物。本研究通過原核表達的方法獲得AHSG重組蛋白,并用其作為腫瘤相關(guān)抗原檢測原發(fā)性肝癌患者、慢性肝病患者和正常人血清中抗AHSG抗體的水平,評價其單獨和并聯(lián)其它腫瘤相關(guān)抗原作為原發(fā)性肝癌

2、診斷指標的價值。
　　 方法：
　　 1.RT-PCR擴增AHSG基因:提取HepG2細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄cDNA,以cDNA為模板,設(shè)計特異性引物,加入限制性酶切位點,擴增目的基因。
　　 2.構(gòu)建重組表達質(zhì)粒及鑒定:將AHSG基因與pMD-18T載體連接,構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒(AHSG-T),將重組克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a細胞中,通過酶切鑒定、特異PCR鑒定和測序確定克隆質(zhì)粒的正確性；用限制性內(nèi)切酶將目的基

3、因從克隆質(zhì)粒上切下,再與表達質(zhì)粒pET-30a(+)連接,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET30a-AHSG,并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a細胞中,通過酶切及特異PCR擴增的方法鑒定重組表達質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。
　　 3.將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達宿主菌大腸桿菌BL21中,構(gòu)建原核表達系統(tǒng)BL21(pET30a-AHSG)。
　　 4.確定最佳誘導(dǎo)條件:確定重組蛋白AHSG表達所需的最佳IPTG誘導(dǎo)濃度和最佳誘導(dǎo)時間。
　　 5.

4、可溶性分析:大量誘導(dǎo)AHSG重組蛋白表達,通過可溶性分析確定AHSG重組蛋白的主要表達形式,優(yōu)化誘導(dǎo)條件增加可溶性蛋白的表達量。
　　 6.蛋白純化:通過鎳離子親和層析的方法純化帶有組氨酸標簽的重組蛋白,并測定純化蛋白的濃度,用Western blot鑒定重組蛋白。
　　 7.通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測原發(fā)性肝癌患者、慢性肝病患者和正常人血清中的AHSG抗體,比較其在原發(fā)性肝癌患者、慢性肝病患者和正常人血

5、清中的水平。
　　 8.以正常人血清中AHSG抗體含量的百分位數(shù)P95作為截斷值,計算肝癌組、慢性肝病組和正常組AHSG抗體陽性率,用篩檢試驗的評價方法評價AHSG檢測原發(fā)性肝癌的診斷價值。
　　 9.并聯(lián)14種腫瘤相關(guān)抗原(AHSG、Calnuc、CyclinE、CDK2、cIAP、RalA、p62、p53、CyclinB1、Koc、Impl、survivin、p16、C-myc)對原發(fā)性肝癌進行診斷,篩選并評價診斷原

6、發(fā)性肝癌的最佳組合。
　　 結(jié)果：
　　 成功構(gòu)建AHSG原核表達系統(tǒng)BL21(pET30a-AHSG)；最佳誘導(dǎo)條件為0.08mmol/L,IPTG誘導(dǎo)3h；可溶性分析顯示目的蛋白主要以不溶性的包涵體形式存在；5mol/L尿素洗滌包涵體的效果最佳；通過鎳離子親和層析的方法純化到AHSG重組蛋白,并經(jīng)蛋白免疫印跡雜交確定了純化蛋白的正確性。
　　 ELISA結(jié)果顯示,原發(fā)性肝癌患者血清中AHSG抗體水平高于慢性肝

7、病患者和正常人,AHSG檢測原發(fā)性肝癌患者的靈敏度僅為13.1％,診斷價值較低。并聯(lián)9種TAAs可使檢測的靈敏度提高到89.8％,特異度為86.8％。9種抗原聯(lián)合檢測的陽性預(yù)測值為86.3％,陽性似然比為6.80,陰性預(yù)測值為90.2％,陰性似然比為0.12。這些指標說明聯(lián)合檢測的診斷價值較高,具有較高的臨床診斷價值。Kappa值為0.76,則說明該試驗的檢測結(jié)果與真實值中度一致。
　　 結(jié)論：
　　 成功構(gòu)建AHSG基