慢性移植腎腎病腎纖維化分子病理機(jī)制研究.pdf

1、目的: 1、研究慢性移植腎腎?。–AN）組織病理學(xué)特點(diǎn)。 2、探討整合素連接激酶（integrin-linked kinase，ILK）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、E-鈣蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、Ⅳ型膠原蛋白（CollagenⅣ）在移植腎組織中表達(dá)的變化及其意義。 3、探討ILK在CAN患者移植腎纖維化中的作用及機(jī)制，進(jìn)一步闡明移植腎慢性纖維化的分子病理機(jī)制，為臨床

2、治療CAN提供相應(yīng)的理論及思路。 方法: 收集30例經(jīng)移植腎穿刺活檢病理確診為無明確病因的腎間質(zhì)纖維化和小管萎縮的移植腎活檢標(biāo)本?；颊邽橥N異體腎移植術(shù)后1～15年出現(xiàn)移植腎功能減退者，平均腎移植時(shí)間為（4．5±3．2）年，其中男22例，女8例，年齡21～59歲，平均（42．4±9．0）歲。25例接受CsA+MMF+Pred三聯(lián)免疫抑制治療方案，5例接受FK506+MMF+Pred方案治療。供、受者血型相同，淋巴細(xì)胞毒交

3、叉配型試驗(yàn)（CDC）<10%，群體反應(yīng)性抗體（PRA）<10%，HLA之A、B、Dr位點(diǎn)至少有2個(gè)位點(diǎn)相配。另以10例正常腎組織作為對照組（正常組），均為正常供體尸腎術(shù)前穿刺活檢標(biāo)本，病理檢查無異常，均為男性，年齡25～50歲，平均（34．8±9．6）歲。40例腎組織標(biāo)本均制成蠟塊，同時(shí)進(jìn)行HE染色，PASM染色和Masson三色染色，同時(shí)行IgG、IgA． IgM、Clq和C4c免疫組化檢測，光鏡下觀察移植腎病理改變。對移植腎組織標(biāo)本

4、按照“Banff'2007”移植腎病理分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理診斷及分級，將病理診斷為無任何特殊病因的間質(zhì)纖維化和小管萎縮（IF/TA）分為：Ⅰ級輕度間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮（<25%的皮質(zhì)受累）；Ⅱ級中度間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮（26%～50%的皮質(zhì)受累）；Ⅲ級重度間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮或喪失（>50%的皮質(zhì)受累），可以包括非特異的血管和腎小球硬化但以小管間質(zhì)病變嚴(yán)重性分級。 所有標(biāo)本均采用免疫組織化學(xué)ELiVisionTM plus二步

5、法檢測腎組織中TGF-β1、ILK、E-cadherin、α-SMA、CollagenⅣ的表達(dá)。圖像分析方法采用Leica Qwin高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)（型號DMR+Q550），通過光學(xué)顯微鏡放大400倍攝取并分析圖像。每例標(biāo)本連續(xù)選取10個(gè)不重疊（避開腎小球和大血管）的腎小管間質(zhì)高倍視野（×400，HPF），觀察部位包括腎皮質(zhì)、皮髓交接處和髓質(zhì)部的腎小管間質(zhì)，每例腎小管總數(shù)>60個(gè)。對所選視野中的陽性信號進(jìn)行圖像分析，用半定量

6、法估計(jì)各因子的表達(dá)情況。在免疫組化標(biāo)本中，計(jì)算每個(gè)視野中腎小管和腎間質(zhì)陽性著色的面積與視野內(nèi)腎小管間質(zhì)總面積（去除腎小管管腔）的比值，計(jì)算其均值代表此例患者某種成分在腎小管和間質(zhì)的相對含量。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，ILK、TGF-β1、E-cadherin、α-SMA和Ⅳ型膠原的表達(dá)量進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)（Levene檢驗(yàn)）后，方差齊者采用單因方差分析（one-way ANOVA）比較各指標(biāo)的組間差異，并采

7、用LSD法進(jìn)行兩組間的多重比較；方差不齊者則采用F檢驗(yàn)Welch法進(jìn)行比較，并采用Dunnett' T3法進(jìn)行兩組間的多重比較，雙變量相關(guān)性采用Pearson相關(guān)或（Spearman相關(guān)系數(shù)）等級相關(guān)分析，取雙側(cè)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05，P<0．05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1、慢性移植腎腎病患者移植腎組織學(xué)改變主要表現(xiàn); 腎間質(zhì)彌漫性纖維化，伴有淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤；腎小管不同程度萎縮，排列較紊

8、亂，基底膜增厚，部分髓質(zhì)集合管代償性擴(kuò)張，蛋白管型常見；腎小球系膜基質(zhì)及系膜細(xì)胞增生，基底膜增厚，腎小球毛細(xì)血管叢節(jié)段性硬化甚至腎小球完全玻璃樣變，部分病例細(xì)小動(dòng)脈內(nèi)膜向心性纖維性增殖，管腔狹窄或閉塞。 2、腎小管間質(zhì)ILK、TGF-β1、E-cadherin、α-SMA和Ⅳ型膠原的表達(dá)變化; 免疫組織化學(xué)染色顯示：在正常腎臟組織，ILK無或僅有極少量表達(dá)；TGF-β1主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿中，多呈弱陽性表達(dá)；E-

9、cadherin在小球和小管的上皮細(xì)胞胞膜上有大量表達(dá)，胞漿中有少量表達(dá)；α-SMA僅表達(dá)于血管平滑肌肌層，在腎間質(zhì)偶有表達(dá)，小管上皮細(xì)胞無表達(dá)；Ⅳ型膠原主要分布在腎小球、腎小管基底膜、腎小球包曼氏囊壁和系膜區(qū)，腎間質(zhì)中少量散在分布，腎小管上皮細(xì)胞中未見表達(dá)。 而在慢性移植腎腎病患者移植腎組織中，ILK主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞胞漿中，表達(dá)水平較正常腎組織明顯增強(qiáng)，隨著間質(zhì)病變程度的加重，ILK表達(dá)顯著增加，分布于從近端

10、小管到髓質(zhì)集合管上皮細(xì)胞胞漿，萎縮變性的腎小管表達(dá)最為強(qiáng)烈，一些發(fā)生變性、壞死、脫落到管腔的小管上皮細(xì)胞也可以見到ILK陽性顆粒，腎間質(zhì)細(xì)胞中亦可見到ILK表達(dá)，間質(zhì)病變越重，表達(dá)量越多，范圍越廣；TGF-β1在小管上皮細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞胞漿中及間質(zhì)基質(zhì)區(qū)多呈強(qiáng)陽性表達(dá)，部分腎小球包曼氏囊壁亦有表達(dá)，偶見于間質(zhì)小血管周圍和血管內(nèi)皮細(xì)胞中；α-SMA除表達(dá)于血管平滑肌肌層外，廣泛分布于間質(zhì)區(qū)域，一些管腔破壞和萎縮的腎小管上皮細(xì)胞胞漿也可

11、見表達(dá)；E-cadherin在腎小管的上皮細(xì)胞胞膜上的表達(dá)較正常腎組織顯著減少，小管間質(zhì)損害越重，表達(dá)量越少；Ⅳ型膠原除在腎小球和腎小管基底膜、腎小球包曼氏囊壁和系膜區(qū)的表達(dá)較正常腎組織有不同程度增加外，在腎間質(zhì)中表達(dá)亦顯著增加，而且在小血管周圍和管壁中也有表達(dá)，腎小管上皮細(xì)胞中則無表達(dá)。 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，ILK、TGF-β1、α-SMA和Ⅳ型膠原在移植組腎小管、間質(zhì)的表達(dá)比正常腎組織顯著增多，兩者間差異均有顯著性（P值

12、均<0．001），ILK、TGF-β1、α-SMA和Ⅳ型膠原的表達(dá)隨移植腎IF/TA的病理分級的加重而呈增加的趨勢，但α-SMA在移植腎IF/TAⅡ級和Ⅲ級組間表達(dá)量差異不顯著（P>0．05）。E-cadherin的表達(dá)在移植組腎小管、間質(zhì)的表達(dá)比正常腎組織顯著減少（P<0．001），并隨移植腎IF/TA的病理分級的加重而呈減弱的趨勢。經(jīng)等級相關(guān)分析，ILK、TGF-β1、α-SMA和Ⅳ型膠原表達(dá)水平均與移植腎IF/TA的病理分級程度呈

13、正相關(guān)，（r分別為0．802、0．939、0．858和0．887，P<0．001），而E-cadherin的表達(dá)水平與移植腎組織小管間質(zhì)病變程度呈負(fù)相關(guān)（r=-0．868，P<0．001）。 在CAN患者移植腎組織中，ILK與TGF-β1、α-SMA和CollagenⅣ的表達(dá)量均呈正相關(guān)（r=0．815，r-0．700，r=0．727，P<0．001），與E-cadherin表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（r=-0．618，P<0．001），I

14、LK與CAN患者的SCr之間呈正相關(guān)（r=0．662，P<0．001）。TGF-β1與α-SMA、CollagenⅣ在移植腎小管間質(zhì)中的表達(dá)量均呈正相關(guān)（r=0．808，r=0．870，P<0．001），而與E-cadherin表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（r=-0．779，P<0．001）。 結(jié)論: 1、慢性移植腎腎病患者移植腎組織學(xué)改變主要表現(xiàn)為腎間質(zhì)纖維化、小管萎縮，腎小球硬化、血管內(nèi)膜增生和單個(gè)核細(xì)胞浸潤。 2、CAN

15、患者移植腎小管間質(zhì)中ILK呈高表達(dá)，其表達(dá)水平隨移植腎IF/TA的病理分級的加重有增加的趨勢，與CAN患者SCr上升呈正相關(guān)，提示ILK的增加與移植腎病理改變的發(fā)生機(jī)制有關(guān)，并與CAN患者的移植腎功能減退有關(guān)。 3、CAN患者移植腎小管間質(zhì)中Ⅳ型膠原表達(dá)水平較正常對照顯著增加，并有隨移植腎IF/TA的病理分級增加而增多的趨勢，說明Ⅳ型膠原的異常沉積是CAN患者移植腎纖維化的重要表現(xiàn)。 4、正常對照腎組織中的小管上皮細(xì)胞的

16、胞膜上有大量的上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，無肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白α-SMA的表達(dá)，而在CAN患者移植腎壞死和萎縮的腎小管上皮細(xì)胞胞膜上的E-鈣蛋白表達(dá)量明顯減少，且E-鈣粘蛋白的表達(dá)水平有隨移植腎IF/TA的病理分級增加而呈逐漸減弱的趨勢，并出現(xiàn)了肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物α-SMA，后者廣泛分布于間質(zhì)區(qū)域，一些管腔破壞和萎縮的腎小管上皮細(xì)胞胞漿也可見表達(dá)。這些結(jié)果提示EMT可能參與了CAN患者移植腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展。

17、 5、在移植腎組織中，TGF-β1呈高表達(dá)，其表達(dá)水平有隨IF/TA的病理分級的增加而增多的趨勢，同時(shí)與Ⅳ型膠原及肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白（α-SMA）表達(dá)水平呈正相關(guān)，而與E-鈣粘蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，提示TGF-β1的上調(diào)可能誘導(dǎo)移植腎小管發(fā)生EMT而參與移植腎的纖維化形成。 6、CAN患者移植腎組織中，ILK的表達(dá)與TGF-β1、α-SMA和CollagenⅣ的表達(dá)均呈正相關(guān)，而與E-cadherin的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。