TRPC6及BKCa通道蛋白在小鼠腎皮質(zhì)和海馬發(fā)育中表達(dá)的研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景:
　　瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道6(TRPC6)，作為TRPC家族的成員之一，最近引起公眾越來(lái)越多的關(guān)注，因?yàn)樗c很多疾病相關(guān)。研究指出，在腦和腎臟中，TRPC6參與多項(xiàng)生理功能。
　　大電導(dǎo)鈣激活鉀離子通道（BKCa通道）廣泛表達(dá)于機(jī)體中多種細(xì)胞，并在許多生理及病理?xiàng)l件下，發(fā)揮著舉足輕重的作用。然而BKCa通道在小鼠生后發(fā)育過(guò)程中腎皮質(zhì)和海馬的分布與表達(dá)還沒(méi)有報(bào)道。
　　此外，TRPC6作為一個(gè)重要的離子通道在

2、腎臟中主要在足細(xì)胞中表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞中的TRPC6對(duì)足細(xì)胞中的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)起著至關(guān)重要的作用。其中，足細(xì)胞是一個(gè)很特別的細(xì)胞類型，它包裹著的腎小球毛細(xì)血管。足細(xì)胞是腎小球毛細(xì)血管上皮細(xì)胞，或稱腎小囊臟層細(xì)胞，屬于一種終末分化細(xì)胞。足細(xì)胞最近一直成為大家的研究熱點(diǎn)，因?yàn)樗娜笔Ш筒∽兌加幸l(fā)腎臟發(fā)育的缺陷，甚至導(dǎo)致許多疾病。正是由于足細(xì)胞在腎臟發(fā)育和疾病發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，引發(fā)了越來(lái)越多的研究者著重于足細(xì)胞上的離子

3、通道的研究。其中很重要的兩個(gè)通道就是TRPC6通道和BKCa通道。研究發(fā)現(xiàn)BKCa通道作為位于足細(xì)胞上的一種重要的離子通道，它在調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　1)觀察和闡明TRPC6和BKCa通道在小鼠出生后發(fā)育的不同時(shí)期，在腎皮質(zhì)和海馬中的分布和表達(dá)。
　　2)探討足細(xì)胞分化過(guò)程中的細(xì)胞形態(tài)學(xué)隨分化成熟的變化。
　　3)探討足細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，離子通道（TRPC6通道和BKCa通

4、道）分布和表達(dá)的變化。
　　4)探討足細(xì)胞分化過(guò)程中，TRPC6通道和BKCa通道電流的變化。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1)在第一部分研究中，我們選取了6-8周的成年C57小鼠雌雄同籠，設(shè)定子代出生后當(dāng)天為出生后0天(P0)。然后取出生后1天，3天，5天，7天，14天，21天，28天和49天（P1，P3，P5，P7，P14，P21，P28和P49）的小鼠，取腦和腎臟，切片或者提蛋白。采用免疫組化和免疫印記的方法檢測(cè)TRPC

5、6通道以及BKCa通道在腎皮質(zhì)和海馬中的分布和表達(dá)。
　　2)在第二部分的實(shí)驗(yàn)研究中，我們采用了小鼠永生足細(xì)胞系MPCs作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，培養(yǎng)未分化的足細(xì)胞，然后去除限制性因素使足細(xì)胞進(jìn)入分化成熟階段。取未分化，分化3，6，9，12，及成熟的足細(xì)胞（d0，d3，d6，d9，d12和mature）進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，以及免疫組化，免疫印記實(shí)驗(yàn)以及全細(xì)胞膜片鉗，研究足細(xì)胞隨分化的形態(tài)變化，TRPC6通道以及BKCa通道在足細(xì)胞分化過(guò)程中的分布

6、與表達(dá)及其功能變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1) TRPC6在腎小體發(fā)育的各個(gè)時(shí)期以及海馬的各區(qū)都有表達(dá)。在海馬中TRPC6的表達(dá)量增加，在出生后P7和P14之間表達(dá)量呈現(xiàn)一個(gè)顯著的增加。同時(shí)， TRPC6在腎皮質(zhì)，尤其是腎小球的表達(dá)隨發(fā)育過(guò)程呈下降趨勢(shì)。
　　2) BKCa通道在小鼠出生后的所有的時(shí)間點(diǎn)的腎小管和腎小球都有發(fā)現(xiàn)，其中包括腎小體的四個(gè)時(shí)期，如逗號(hào)狀的身體，S形身材，Ⅲ期和Ⅳ期腎小體。在發(fā)育過(guò)程中，BKCa

7、通道的表達(dá)明顯降低，其中最大的變化是P7和P14之間的。與此相對(duì)應(yīng)，BKCa通道在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的海馬所有區(qū)域都有表達(dá)，且在P1-P14含量逐漸增加，其中P7和P14之間的有一個(gè)迅速的增加。
　　3)我們的研究結(jié)果表明，TRPC6通道的分布隨足細(xì)胞分化成熟而改變。而且隨著分化，細(xì)胞表面TRPC6表達(dá)的熒光強(qiáng)度逐漸增加，同時(shí)全細(xì)胞TRPC6通道電流也隨之增加。
　　4) BKCa通道的分布隨足細(xì)胞系的分化成熟而改變。此外，激光共聚

8、焦顯微鏡觀察到，隨著足細(xì)胞的分化，細(xì)胞表面的BKCa通道蛋白表達(dá)增加。這與我們提取不同分化時(shí)期的足細(xì)胞的膜蛋白，然后進(jìn)行的免疫印記的結(jié)果是一致的。此外，膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BKCa通道電流的變化也與上述結(jié)果相符。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　1) TRPC6在小鼠出生后發(fā)育過(guò)程中，在腎皮質(zhì)中的表達(dá)逐漸降低，而在海馬中的表達(dá)量逐漸增高。這些數(shù)據(jù)表明，TRPC6不僅參與維持腎皮質(zhì)的相關(guān)功能，而且對(duì)于大腦中海馬的發(fā)育也是十分重要的。

9、　　2)本研究的結(jié)果表明，BKCa通道在小鼠出生后腎皮質(zhì)和海馬發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。而在腎皮質(zhì)和海馬，BKCa通道發(fā)揮的功能可能有所不同。從而為以后有關(guān)研究腎臟和海馬發(fā)育及相關(guān)作用，提供了理論基礎(chǔ)，更為進(jìn)一步臨床研究提供理論依據(jù)。
　　3) TRPC6隨發(fā)育變化說(shuō)明TRPC6可能參與了足細(xì)胞的成熟和相關(guān)的生理功能。這些有關(guān)腎臟生理和發(fā)育的結(jié)果，為今后探討足細(xì)胞上相關(guān)離子通道的研究提供了理論基礎(chǔ)。
　　4)隨著足細(xì)胞的成熟