miR-155對A549細(xì)胞Weel表達(dá)調(diào)控的研究.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文miR155對A549細(xì)胞Weel表達(dá)調(diào)控的研究姓名：曹學(xué)武申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：陳正堂20080501第三軍醫(yī)人學(xué)博十學(xué)位論文miR155影響NsCLC患者預(yù)后的機(jī)制目前尚未明了。Yoshida等報(bào)道用免疫組化的方法觀察到約2／3的NSCLC患者Weel表達(dá)缺失，Weel表達(dá)的減少與患者預(yù)后不良及高復(fù)發(fā)率相關(guān)。同時這些weel表達(dá)缺失的腫瘤細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)。還發(fā)現(xiàn)，weel蛋白表達(dá)水平不是

2、在DNA水平被調(diào)控，而可能是通過其它機(jī)制被調(diào)控。miR一155對weel表達(dá)的影響尚未見報(bào)道。結(jié)合文獻(xiàn)，我們用生物信息學(xué)的方法對miR一155和weelmRNA3’uTR的相互作用進(jìn)行了初步預(yù)測，推測weelmRNA為miR一155的靶mRNA，miR一155可能通過影響NSCLC紐胞的Weel表達(dá)進(jìn)而影響患者NSCLC的預(yù)后。研究目的觀察成熟miR一155在NSCLc的表達(dá)，探討miR一155對A549細(xì)胞w的lmRNA和蛋白表達(dá)的調(diào)

3、控及其意義。實(shí)驗(yàn)方法l、觀察成熟miR一155在肺腺癌、肺鱗癌、A549細(xì)胞和H157細(xì)胞的表達(dá)水平：采用Ambion公司的nlirVanaTMmiRNAIs01ationKit提取成熟miRNAs，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。采用Ambion公司的mifVanaTMqImPCRmiRNADetectionKit、mirVanaTMqR，rPCRPrimerSet、SuperTaqTMThermostableDNAPolymerase

4、和IDT公司合成的標(biāo)準(zhǔn)成熟miR一155模板，進(jìn)行絕對實(shí)時定量RTPCR，測定肺腺癌、肺鱗癌、相應(yīng)癌旁正常組織、A549細(xì)胞和H157細(xì)胞中成熟miR155的表達(dá)水平。2、采用TargetScan、miRanda和PicTar方法預(yù)測miR一155與WeelmRNA3’一UTR的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，mFOLD法測算互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)5’和3’端70個核苷酸的自由能△G。3、觀察miR一155對A549細(xì)胞weelmRNA表達(dá)水平的影響：采用特異性的

5、miR155抑制劑AMOs抑制A549細(xì)胞內(nèi)成熟miR一155的活性，以GAPDHmRNA為內(nèi)參，采用相對實(shí)時定量RTPCR法測定weelmRNA表達(dá)水平。4、觀察miR一155對A549細(xì)胞w色e1蛋白和Phospho—cdc2(T”15)蛋白表達(dá)水平的影響：采用特異性的miR一155抑制劑AMOs抑制A549細(xì)胞內(nèi)成熟miR一155的活性，以組蛋白H3為內(nèi)參，采用W色stemblot測定Weel蛋白和Phospho—cdc2(Tyr