小鼠組織特異性高表達(dá)miR-155對(duì)血糖調(diào)節(jié)的作用及機(jī)制.pdf

1、背景和目的：
　　糖尿病是一種遺傳和環(huán)境因素共同作用而形成的多基因遺傳性復(fù)雜疾病，并且會(huì)導(dǎo)致許多嚴(yán)重的并發(fā)癥如終末期腎臟病、心血管疾病、失明和截肢。但糖尿病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前，全世界的糖尿病患病率迅速增加，發(fā)展中國家尤為明顯，因此，積極探索糖尿病的發(fā)病機(jī)制和尋找有效的治療靶點(diǎn)具有重要意義和現(xiàn)實(shí)緊迫性。
　　微小RNA(microRNAs，miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA分子，

2、參與了多種生理和病理過程。miR-155是一個(gè)典型的多功能miRNA。研究提示miR-155在糖脂代謝和調(diào)節(jié)胰島素敏感性中可能發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)新診斷T2DM患者血清miR-155水平顯著低于對(duì)照組，但miR-155在調(diào)節(jié)糖代謝、胰島素敏感性和糖尿病發(fā)生發(fā)展中的具體作用和機(jī)制尚待進(jìn)一步明確。
　　此外，大量研究已證實(shí)，miRNA可能在胰島素作用的靶組織如肝臟、骨骼肌和脂肪中發(fā)揮著重要作用。miRNA的異常表達(dá)可能影

3、響這些組織的糖脂代謝，與胰島素抵抗、糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)。因此，為了進(jìn)一步研究miR-155在血糖調(diào)節(jié)和胰島素敏感性中的作用，本課題組擬利用肝臟和骨骼肌過表達(dá)miR-155轉(zhuǎn)基因的Rm155LG轉(zhuǎn)基因小鼠解析miR-155對(duì)糖代謝和胰島素敏感性的調(diào)節(jié)作用。
　　方法:
　　1. Rm155LG轉(zhuǎn)基因小鼠篩選與鑒定及其繁殖傳代
　　借助小動(dòng)物活體成像儀或體視熒光顯微鏡，檢測mRFP表達(dá)以篩選和鑒定Rm155LG轉(zhuǎn)基因小鼠

4、，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。
　　2.利用Rm155LG轉(zhuǎn)基因小鼠，建立骨骼肌過表達(dá)miR-155的Rm155LG轉(zhuǎn)基因小鼠
　　利用Rm155LG轉(zhuǎn)基因小鼠，借助小動(dòng)物活體成像儀檢測Rm155LG轉(zhuǎn)基因小鼠與Ckmm-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠(為雜合子)交配所生后代的Luc表達(dá)，篩選出骨骼肌表達(dá)Luc的Rm155LG/Ckmm-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠并建系，通過qRT-PCR明確轉(zhuǎn)基因小鼠肌肉miR-155表達(dá)水平。
　　3.初步探討mi

5、R-155在糖代謝中的作用
　　1)比較C57小鼠隨機(jī)、禁食24小時(shí)和禁食后重新喂養(yǎng)6小時(shí)的血糖差異。
　　2)利用qRT-PCR和蛋白免疫印跡(Western blot)檢測C57小鼠糖代謝相關(guān)基因和miR-155的表達(dá)。
　　4.利用miR-155轉(zhuǎn)基因小鼠初步探討miR-155對(duì)糖代謝的影響及機(jī)制
　　1)利用本研究構(gòu)建的Rm155LG/Ckmm-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠和課題組前期構(gòu)建的肝臟特異性高表達(dá)miR-1

6、55小鼠（Rm155LG/Alb-Cre），與對(duì)照小鼠，對(duì)比腹腔糖耐量(IPGTT)、胰島素耐量(ITT)和丙酮酸耐受試驗(yàn)(PTT)的差異。
　　2)利用qRT-PCR和Western blot檢測Rm155LG/Alb-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠糖代謝相關(guān)基因表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.小動(dòng)物活體成像儀的檢測結(jié)果表明，miR-155轉(zhuǎn)基因在Rm155LG/Ckmm-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌上成功被激活。
　　2. C57

7、小鼠空腹血糖顯著低于隨機(jī)和空腹后重新喂養(yǎng)6小時(shí)的血糖。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，空腹后肝臟糖異生相關(guān)基因如PEPCK, G6PC和PGC-1表達(dá)水平顯著升高，而miR-155表達(dá)水平顯著降低，表明miR-155可能與肝臟糖異生相關(guān)。
　　3. IPGTT, PTT和ITT結(jié)果顯示Rm155LG/Alb-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠糖耐量和胰島素敏感性增加，肝臟糖異生能力下降。
　　4. IPGTT和ITT結(jié)果顯示

8、Rm155LG/Ckmm-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠糖耐量和胰島素敏感性增加。
　　5. Rm155LG/Alb-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟qRT-PCR結(jié)果顯示，糖異生、糖酵解和三羧酸循環(huán)相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)肝臟糖異生相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.運(yùn)用Cre/loxP系統(tǒng)，在Rm155LG/Ckmm-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠上實(shí)現(xiàn)了骨骼肌組織特異性高表達(dá)miR-155轉(zhuǎn)基因的激活。
　　2.利用