非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞及其順鉑耐藥細(xì)胞株DNA和組蛋白表觀遺傳差異的研究.pdf

1、目的：探討非小細(xì)胞肺癌及其順鉑耐藥細(xì)胞株DNA和組蛋白的表觀遺傳學(xué)差異。
　　方法：選取野生型非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549和H838細(xì)胞株，采用逐漸增加順鉑濃度并大劑量沖擊相結(jié)合的方法誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的耐藥細(xì)胞群，誘導(dǎo)后繼續(xù)在正常培養(yǎng)液中培養(yǎng)21天，分別在誘導(dǎo)后第1天、6天、11天、16天和21天，收細(xì)胞提取DNA、RNA和蛋白，行如下檢測(cè)：MSP研究DNMT1基因和DNMT3b基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)；染色體免疫共沉淀(Ch

2、IP)研究DNMT1基因、DNMT3b基因、H3K4Me2和H3K9Me2的關(guān)系；Infnium研究基因組甲基化狀態(tài)，根據(jù)甲基化變化適當(dāng)調(diào)整檢查的時(shí)間點(diǎn)；熒光定量PCR(qRT-PCR)研究DNMT1、DNMT3b和MDR1的mRNA表達(dá)；流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡；Western blotting檢測(cè)DNMT1、DNMT3b和MDR1蛋白表達(dá)，其中DNMT1和DNMT3b的表達(dá)包括全細(xì)胞、胞漿、胞核內(nèi)游離蛋白和結(jié)合于染色體

3、的蛋白；CCK-8檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活性。
　　結(jié)果：⑴兩株非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株經(jīng)30周順鉑誘導(dǎo)，最終可于目標(biāo)順鉑濃度2.0ug/ml的培養(yǎng)液中穩(wěn)定增殖，表明細(xì)胞株順鉑耐藥誘導(dǎo)成功。⑵順鉑耐藥細(xì)胞株脫離順鉑培養(yǎng)后在不同的時(shí)間點(diǎn)收集樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著去藥物培養(yǎng)時(shí)間的增加，Western blotting，qRT-PCR, ChIP, MSP, Infinium，DNMT1、DNMT3b基因甲基化水平降低，使該基因mRNA，蛋白，組蛋白以及整

4、體基因組甲基化水平表達(dá)均出現(xiàn)先遞減后遞增的一致趨勢(shì)，并且能導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞增殖能力亦可先減弱后增強(qiáng)。
　　結(jié)論：①非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株經(jīng)誘導(dǎo)順鉑耐藥后，能逆轉(zhuǎn)DNMT1、DNMT3b甲基化狀態(tài)，進(jìn)一步說明表觀遺傳可以逆轉(zhuǎn)的性質(zhì)，為臨床長(zhǎng)期進(jìn)行表觀遺傳治療提供依據(jù)。②非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥細(xì)胞株DNMT1、DNMT3b基因的mRNA、蛋白表達(dá)趨勢(shì)和在細(xì)胞周期的不同時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)周期阻滯與這兩個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)有著較為密切的聯(lián)系