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1、研究背景:
肺癌是目前全球發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤之一。在我國(guó),肺癌的發(fā)病率在逐年上升,并且已經(jīng)成為我國(guó)城市人口癌癥死亡的主要原因。非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌的主要病理類型,占80%左右。由于早期肺癌缺乏特異性癥狀,65%-70%的NSCLC患者確診時(shí)已處于晚期,失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。晚期肺癌治療一般采取多學(xué)科綜合治療,其中化療是最重要手段之一。自80年代以來(lái),隨
2、著第三代化療藥物不斷涌現(xiàn),以鉑類為基礎(chǔ)聯(lián)合第三代化療新藥的方案成為晚期NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)化療(Standard Chemotherapy, SC)方案,但其化療的有效率(Response Rate, RR)僅為30%-40%,NSCLC的5年生存率僅為15%。而造成化療失敗的主要原因是耐藥。
一直以來(lái),順鉑被認(rèn)為是晚期NSCLC化療的基石,幾乎所有一線NSCLC化療方案都是與順鉑聯(lián)合應(yīng)用的方案。順鉑的抗癌作用機(jī)制是藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)
3、胞后,與DNA交叉連接,形成穩(wěn)定的順鉑-DNA復(fù)合物,阻斷DNA復(fù)制,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。當(dāng)前認(rèn)為導(dǎo)致順鉑耐藥的機(jī)制包括腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低、藥物在細(xì)胞內(nèi)被降解代謝以及DNA損傷修復(fù)增強(qiáng)。除此之外,還包括凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變。順鉑抗腫瘤作用的主要機(jī)制是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生改變主要由于細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常,凋亡相關(guān)因子表達(dá)異常引起。
POTE基因家族是靈長(zhǎng)類生物所特有的,包含13個(gè)高度同源的基
4、因亞型,分別位于8條不同的染色體上。在多種腫瘤組織(前列腺癌,結(jié)腸癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌和胰腺癌)及生殖細(xì)胞中表達(dá),但在正常組織中不表達(dá)。在腫瘤組織中高表達(dá)的主要亞型是POTE-2γ和POTE-2α。目前POTE的功能尚不明確。有研究在Hela細(xì)胞及精子細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),POTE可能與Fas/FasL、BAK、Casepase-3等凋亡相關(guān)蛋白相互作用,與凋亡信號(hào)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室前期運(yùn)用二維凝膠電泳及質(zhì)譜分析的方法,在A549(人肺腺癌細(xì)胞珠
5、)和A549/DDP(順鉑誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞株)中分析差異性蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn):POTE蛋白在A549/DDP細(xì)胞株中表達(dá)明顯低于A549細(xì)胞。本研究旨在篩選出在A549細(xì)胞中起主導(dǎo)作用的POTE亞型,并分析其在A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞中的表達(dá)差異。收集應(yīng)用含鉑雙藥治療的臨床樣本(腫瘤組織),初步分析POTE表達(dá)變化與NSCLC患者化療療效之間的關(guān)系。本研究共分三部分進(jìn)行:
第一部分:A549/DDP耐藥株建立及生物學(xué)行為鑒定<
6、br> 【目的】
A549細(xì)胞株基礎(chǔ)上誘導(dǎo)的A549/DDP細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)行為的鑒定。
【方法】
采用順鉑敏感人肺腺癌細(xì)胞株A549經(jīng)順鉑誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)順鉑耐藥的耐藥細(xì)胞株A549/DDP;MTT法檢測(cè)兩細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性。
1.人肺腺癌敏感細(xì)胞株A549順鉑誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥的細(xì)胞株A549/DDP。
2. MMT法檢測(cè)結(jié)果顯示順鉑對(duì)A549和A549/DDP細(xì)胞的增殖均有抑制作用,
7、順鉑對(duì)A549和A549/DDP細(xì)胞的IC50值分別為5.6和42.6ug/ml,耐藥倍數(shù)為7.57倍。
【結(jié)論】
成功獲得了人非小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP,明確耐藥細(xì)胞株的耐藥指數(shù)為7.57倍。
第二部分:POTE蛋白在A549細(xì)胞中主要的表達(dá)亞型及其在鉑類耐藥中的作用和機(jī)制
【目的】
本部分實(shí)驗(yàn)旨在篩選出A549細(xì)胞中POTE主要表達(dá)的亞型,明確其在A549和A549/DD
8、P細(xì)胞中分子水平和蛋白水平的表達(dá)差異,探討POTE-2γ與凋亡相關(guān)因子(Fas、Bax、Bak、Caspase-3)的關(guān)系。
【材料和方法】
1.運(yùn)用Trizol提取A549細(xì)胞中的總RNA;
2.運(yùn)用PCR產(chǎn)物克隆篩選的方法,篩選出62個(gè)菌落測(cè)序;
3.運(yùn)用DNAstar軟件進(jìn)行堿基比對(duì);
4.應(yīng)用蛋白印跡法(Western Blot, WB)驗(yàn)證POTE-2γ在A549和A549/D
9、DP細(xì)胞中的表達(dá)差異;
5.運(yùn)用蛋白印跡的方法分別檢測(cè)順鉑在不同時(shí)間和濃度梯度時(shí),A549及A549/DDP兩細(xì)胞株中POTE-2γ及凋亡相關(guān)因子(Fas、Bax、Bak、Caspase-3)表達(dá)量的變化;
6.構(gòu)建慢病毒載體,感染 A549細(xì)胞,下調(diào)POTE-2γ表達(dá),蛋白印跡檢測(cè)目標(biāo)蛋白(Fas、Bax、Bak)表達(dá)變化。
【結(jié)果】
1.PCR克隆篩選出的62個(gè)菌落中,其中4個(gè)測(cè)序失敗,58個(gè)
10、完成測(cè)序。完成測(cè)序的58個(gè)序列通過(guò)堿基比對(duì)均為POTE-2γ。
2.慢病毒對(duì)A549細(xì)胞中POTE-2γ表達(dá)量的干擾效率約73.6%。
3.蛋白印跡法及免疫細(xì)胞化學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示POTE-2γ在A549及A549/DDP兩細(xì)胞株間存在表達(dá)差異。
4.蛋白印跡結(jié)果顯示順鉑在不同時(shí)間和濃度梯度 POTE-2γ在 A549及 A549/DDP兩細(xì)胞株間存在表達(dá)差異。
5.在 A549細(xì)胞中下調(diào) POTE-
11、2γ的表達(dá),凋亡相關(guān)蛋白(Fas、Bax、Bak)表達(dá)的表達(dá)量也相應(yīng)下調(diào)。
【結(jié)論】
1.在A549細(xì)胞中主要表達(dá)的POTE亞型是POTE-2γ。
2. POTE-2γ在A549細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于A549/DDP細(xì)胞。
3. POTE-2γ可能通過(guò)上調(diào)Fas等促凋亡因子,下調(diào)Bax,Bak等抗凋亡受體發(fā)揮促凋亡作用,而與順鉑耐藥相關(guān)。
第三部分:NSCLC患者組織中POTE-2γ表達(dá)
12、水平與含鉑雙藥化療療效的相關(guān)性
【目的】探討POTE-2γ表達(dá)與晚期NSCLC患者一線使用含鉑雙藥方案治療的療效的關(guān)系。
【材料和方法】
1.收集接受一線含鉑雙藥治療的晚期NSCLC患者的腫瘤組織;
2.采用Trizol法提取組織中的總RNA;
3.采用Fermentas RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄;
4.采用實(shí)時(shí)熒光
13、定量PCR檢測(cè)組織中POTE-2γ的表達(dá)量;
5.運(yùn)用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)。
【結(jié)果】
1. POTE-2γ高表達(dá)的患者一線使用含鉑雙藥方案的療效優(yōu)于低表達(dá)者,且與患者的性別相關(guān)(P=0.003);
2. POTE-2γ高表達(dá)的患者TTP(Time To Progress)和OS(Over Servival)均長(zhǎng)于POTE-2γ低表達(dá)的患者。
【結(jié)論】
POTE-2γ可能可以作
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