乳抗氧化肽的分離、純化及生物活性研究.pdf

1、乳是人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的一種重要來(lái)源，它含有人體所需的全部蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和生長(zhǎng)因子。乳清是干酪工業(yè)的副產(chǎn)品。β-乳球蛋白和α-乳白蛋白是乳清中的主要蛋白質(zhì)，約占乳清蛋白質(zhì)的75％，是生物活性肽的重要來(lái)源。 本文以乳清分離蛋白(WPI)為研究對(duì)象，系統(tǒng)研究了WPI的酶解工藝，采用不同檢測(cè)體系評(píng)價(jià)了WPI酶解物的抗氧化活性，采用凝膠過(guò)濾色譜、反相-高效液相色譜(RP-HPLC)等方法對(duì)乳抗氧化肽進(jìn)行分離純化，并研究了其結(jié)構(gòu)表

2、征和生物活性，為將來(lái)開(kāi)發(fā)乳抗氧化肽產(chǎn)品提供理論數(shù)據(jù)。主要結(jié)論如下： 1.以還原能力、羥基自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力為指標(biāo)，研究了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶的WPI酶解物的抗氧化活性。結(jié)果表明WPI酶解物能夠有效清除DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基并具有較強(qiáng)的還原能力，并且在一定濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增加而增強(qiáng)。其中木瓜蛋白酶酶解物的抗氧化能力最強(qiáng)。因此，確定木瓜蛋

3、白酶作為制備乳抗氧化肽的實(shí)驗(yàn)用酶。此外，WPI雖然也有一定的抗氧化能力，但與WPI酶解物相比，其抗氧化作用較弱。 2.采用單因素分析酶用量、溫度和時(shí)間對(duì)WPI酶解物抗氧化活性的影響。以DPPH自由基清除能力為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法確定了木瓜蛋白酶的最佳酶解工藝條件：木瓜蛋白酶用量，酶解溫度，酶解時(shí)間進(jìn)行分析并建立回歸模型：酶解溫度46℃，酶解時(shí)間3.6 h，酶用量2.2％(E／S)，此條件下獲得的酶解產(chǎn)物的抗氧化活性最強(qiáng)。

4、 3.實(shí)驗(yàn)比較了6種大孔吸附樹(shù)脂的脫鹽效果，結(jié)果表明DA201-C型大孔樹(shù)脂對(duì)WPI酶解物的脫鹽效果最好。 4.檢測(cè)了不同分子量的WPI酶解物的抗氧化活性。WPI酶解物用二種不同的超濾膜(MWCO 10和5 kDa)分成三個(gè)組分。結(jié)果表明各個(gè)組分顯示出不同的抗氧化活性，其中分子量小于5 kDa的組分最強(qiáng)。 5.采用凝膠過(guò)濾色譜對(duì)低分子量WPI酶解物進(jìn)行分離，收集抗氧化活性強(qiáng)的組分；抗氧化能力強(qiáng)的組分繼續(xù)采用RP-HP

5、LC進(jìn)一步純化以獲得單一的肽。 6.采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對(duì)純化的乳抗氧化肽的氨基酸序列進(jìn)行了測(cè)定并結(jié)合氨基酸組成分析結(jié)果。最終鑒定其結(jié)構(gòu)為His-Ile-Arg，分子量為425.28 Da。 7.乳抗氧化肽在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)有抑制作用，抑制率具有明顯的劑量依賴(lài)性。 8.乳抗氧化肽對(duì)大鼠紅細(xì)胞溶血抑制率隨著濃度的增加而增加，其中在1.25mg／mL

6、和2.5 mg／mL濃度下的作用效果較為顯著。這表明乳抗氧化肽能夠抑制紅細(xì)胞溶血反應(yīng)的發(fā)生，有效保護(hù)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。 9.乳抗氧化肽對(duì)體外溫育和H2O2誘導(dǎo)的小鼠肝勻漿MDA生成具有較強(qiáng)的抑制作用而且呈量效關(guān)系。其中對(duì)Fe2+誘導(dǎo)的MDA生成的抑制作用稍差，對(duì)H2O2誘導(dǎo)的大鼠紅細(xì)胞氧化溶血的影響表現(xiàn)不明顯。 10.采用小鼠脾淋巴細(xì)胞，研究了乳抗氧化肽的免疫調(diào)節(jié)活性。結(jié)果表明乳抗氧化肽在濃度為200 μg／mL時(shí)能夠